Estudo da influência da temperatura de secagem e solvente extrator na capacidade antioxidante de folhas Plantago major

Resumo

O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da temperatura de secagem e solvente extrator na composição de fenóis totais, flavonoides e capacidade antioxidante das folhas da Plantago major (nome comum Brasileiro: Tansagem). O conteúdo de fenóis totais foi determinado pelo método Folin-Ciocalteu e de flavonoides com AlCl₃. A capacidade antioxidante foi determinada pelos métodos de sequestro do radical livre DPPH^. e ABTS^.+. Os resultados demonstraram que o solvente EtOH/H₂O 70:30 v/v (40 °C) foi o mais eficiente na extração de fenólicos totais. O aumento da temperatura de secagem diminuiu o percentual destes compostos, mas influenciou pouco na degradação dos flavonoides. O aumento da temperatura de secagem diminuiu também o potencial antioxidante dos extratos pelo método de sequestro do radical DPPH•. A melhor resposta frente este radical foi com EtOH/H₂O 70:30 v/v e MeOH/H₂O 95:5 v/v (40 °C). A atividade antioxidante pelo método ABTS^.+ teve pouca influência da temperatura de secagem e do solvente extrator. Nossos estudos colaboram para desenvolver formulações da tansagem que levem a um melhor aproveitamento dos seus componentes principais, incluindo produtos farmacêuticos, alimentícios e cosméticos industriais.

Palavras-chave:

Plantago major.

Fenóis totais.

Flavonoides.

Capacidade antioxidante.

Abstract

The objective of this study was to evaluate the influence of drying temperature and extractive solvent on the composition of total phenols, flavonoids and antioxidant capacity of Plantago major leaves (common name Brazilian: Tansagem). The content of total phenols was determined by the Folin-Ciocalteu method and flavonoids by the AlCl₃. The antioxidant capacity was determined by the free radical scavenger DPPH^. and ABTS^.+ methods. The results demonstrated that the EtOH/H₂O 70:30 v/v solvent (40 °C) was the most efficient in the extraction of total phenolics. The increase in the drying temperature decreased the percentage of these compounds, but little influenced the degradation of flavonoids. The increase in the drying temperature decreased the antioxidant potential of the extracts. The best response against this radical was using EtOH/H₂O 70:30 v/v and MeOH/H₂O 95:5 v/v (40 °C). The antioxidant activity by the ABTS^.+ method had litlle influence on drying temperature and extractor solvent. Our studies collaborate to develop formulations of the tansagem that lead to better use of its main components, including pharmaceutical, food and cosmetic industries products.

Keywords:

Plantago major.

Total Phenols.

Flavonoids.

Antioxidant capacity.

Introdução

Segundo a Organização Mundial da Saúde, cerca de 65 a 80% da população dos países em desenvolvimento depende das plantas medicinais para os cuidados primários com a saúde, devido às condições de pobreza e falta de acesso aos medicamentos^[1]. O Ministério da Saúde (MS), com o intuito de aperfeiçoar pesquisas com plantas medicinais nativas divulgou no ano de 2009, a Relação Nacional de Plantas Medicinais de benefício ao SUS (RENISUS). Essa lista é constituída por 71 espécies vegetais, com potencial de avançar nas etapas da cadeia produtiva e com objetivo de serem pesquisadas para que sejam adotadas com segurança e eficácia gerando produtos de interesse do Ministério da Saúde. Dentre estas plantas encontra-se a tansagem (Plantago major), objeto de estudo deste trabalho^[2].

Plantago major L. é uma planta de interesse medicinal pertencente à família Plantaginaceae, sendo conhecida popularmente como tanchagem, tansagem, transagem, tanchagem maior. Originada do norte da Europa e na Ásia Central, é agora distribuída em todo mundo^[3]. Essa planta é utilizada na medicina popular brasileira como anti-inflamatório, antibiótico, para infecções da boca, garganta, urinárias, ginecológicas e oculares, diurético, analgésico, antigripal, cicatrizante, eupéptico, antiúlcera gástrica, contra cálculos renais, contra hidropisias e antiespasmódico^[4].

A Tansagem apresenta algumas propriedades terapêuticas como, atividade anti-inflamatória e hematoprotetora^[5-7], antibacteriana^[8], anticâncer^[9], atividade antioxidante^[10-12], antiviral^[13,14], antidiabética^[15], entre outras. Seus constituintes químicos principais são alcaloides, compostos fenólicos (derivados do ácido cafeico), flavonoides (principalmente luteolina e apigenina), alcaloides, terpenoides e iridoides glicosilados, ácidos graxos, polissacarídeos e vitaminas. Estes compostos podem ser encontrados em quase todas as partes da planta, como semente, folhas, flores e raízes^[16].

As evidências sobre o seu efeito prejudicial dos radicais livres no organismo têm motivado cada vez mais as pesquisas em relação aos antioxidantes. Seu excesso no organismo exibe efeitos maléficos, estando relacionados com várias patologias^[17,18].

A busca por compostos bioativos de origem natural com alta capacidade antioxidante vem aumentando nas duas últimas décadas, principalmente devido ao seu potencial preventivo^[19]. Encontrar métodos extrativos eficientes é importante para a obtenção de um produto final com elevados teores de substâncias ativas, e uma das estratégias é combinar solventes com diferentes polaridades^[20].

A secagem é o processo no qual um líquido é retirado da superfície ou interior de um material através da evaporação e transferência de calor e massa. Apresenta vantagens por aumentar a vida útil, ter baixo custo, facilitar a armazenagem e o transporte dos produtos e concentrar seus componentes químicos^[21]. Apesar das vantagens, um grande número de transformações químicas ocorre durante a operação de secagem juntamente com as transformações físicas, sendo necessária a análise da qualidade do produto final^[22]. Estudos realizados com produtos naturais têm demonstrado a influência da temperatura de secagem e do solvente extrator na atividade antioxidante e na extração de compostos bioativos^[23-26].

O presente trabalho teve como objetivo realizar a secagem das folhas da tansagem em três diferentes temperaturas, utilizar diferentes sistemas de solvente para extração dos compostos bioativos e analisar como esses fatores afetam seu potencial antioxidante e sua composição de fenólicos totais e flavonoides.

Material e Métodos

Coleta e secagem das folhas de tansagem

As folhas de P. major (tansagem) foram coletadas no Colégio Agrícola Manoel Ribas de Apucarana e identificadas pelo Engenheiro Agrônomo Nilton Yoshio Fukushima. A secagem das folhas da tansagem foi realizada em estufa de circulação e renovação de ar (marca SOLAB, modelo 102/480) nas temperaturas de 40, 60 e 80 °C, até peso constante. Após a secagem, os produtos desidratados foram triturados em liquidificador doméstico, armazenados e mantidos em geladeira para a realização das análises.

Preparação dos extratos

Os produtos desidratados foram submetidos à extração com os solventes: etanol/água (EtOH/H₂O) 95:5 e 70:30 (v/v), metanol/água (MeOH/H­2O) 95:5 e 70:30 (v/v). Para a extração foram utilizados 1,00 g das folhas e 100 mL de cada solvente, durante 24 h sob agitação magnética ao abrigo da luz. Após este tempo, os extratos foram filtrados, utilizando-se funil analítico e papel filtro qualitativo (80 g/m²), para balões volumétricos de 100 mL e o volume ajustado. Os extratos foram armazenados sob refrigeração ao abrigo da luz para análises posteriores.

Determinação do teor de flavonoides totais

Os flavonoides totais dos extratos foram determinados segundo metodologia reportada na literatura^[27] com modificações. Foram pipetados 2,0 mL de cada extrato na concentração de 10.000 µg mL^-1 em tubos de ensaio individualmente. Adicionou-se 1,0 mL de reagente metanol-cloreto de alumínio a 5% e 2,0 mL de metanol. Preparou-se um branco utilizando 4,0 mL de metanol e 1,0 mL de metanol-cloreto de alumínio 5%. As leituras foram realizadas após 30 min, a 425 nm em espectrofotômetro (Agilent Tecnologies, modelo Cary 60 UV-VIS). Uma curva de calibração foi preparada com uma solução metanólica de rutina nas concentrações de 25, 50, 75, 100, 125, 150 e 200 µg mL^-1 (y = 0,001x – 0,013; R² = 0,994). Os resultados foram expressos em mg de rutina por grama de extrato.

Determinação do conteúdo de fenóis totais

O conteúdo de fenóis totais dos extratos foi determinado usando o reagente Folin-Ciocalteu de acordo com a metodologia descrita^[28]. Foram adicionados 0,5 mL do extrato na concentração de 10.000 µg mL^-1, 8,0 mL de água e 0,5 mL do reagente Folin-Ciocalteau a um tubo de ensaio. Agitou-se em vortex e após 3 min adicionou-se 1,0 mL de uma solução de carbonato de sódio saturada a 15%. Foi conduzido um branco nas mesmas condições, substituindo a amostra por 0,5 mL do solvente extrator. Após uma hora as leituras foram realizadas em espectrofotômetro (Agilent Tecnologies, modelo Cary 60 UV-VIS) na absorvância de 760 nm. Uma curva padrão de ácido gálico nas concentrações de 100, 80, 60, 40, 20, 10 µg mL^-1 foi construída (y = 5,634x – 0,032; R² = 0,997) e os resultados foram expressos em mg EAG 100 g^-1 de amostra, onde EAG representa o equivalente em ácido gálico.

Determinação da atividade antioxidante pelo método de sequestro do radical livre DPPH.

Para determinação da atividade antioxidante dos extratos foi utilizada uma solução 60 µM de DPPH^. (2,2-difenil-1-picril-hidrazila) em metanol (MeOH). Em uma cubeta adicionaram-se 2,0 mL de amostra (concentrações de 10.000 e 1.000 µg mL^-1) e 2,0 mL da solução do radical DPPH^.. Para o controle positivo foram adicionados 2,0 mL de MeOH e 2,0 mL da solução do radical, enquanto que para o branco da amostra, adicionaram-se 2,0 mL de MeOH e 2,0 mL da solução do extrato. A seguir foram realizadas as leituras a cada um minuto em espectrofotômetro (Agilent Tecnologies, modelo Cary 60 UV-VIS) a 517 nm, durante 30 min^[29]. A atividade antioxidante foi expressa como porcentagem de inibição em relação ao controle positivo, de acordo com a equação (1), na qual (A_c) representa a absorvância do controle positivo, (A_b) a absorvância do branco e (A_a) representa a absorvância da amostra. Foi utilizado como padrão o BHT (butil-hidroxi-tolueno) e ácido ascórbico a uma concentração de 100 µg mL^-1.

(1)

Determinação da atividade antioxidante pelo método de sequestro do radical livre ABTS^.+

A atividade antioxidante dos extratos foi determinada segundo a metodologia descrita na literatura^[30]. O radical ABTS^.+ (2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)) foi preparado a partir da reação 5,0 mL da solução estoque de ABTS^.+ (192,0 mg de ABTS^.+ em 50,0 mL de água destilada) e 88 µL da solução de persulfato de potássio (378,4 mg persulfato de potássio em 10,0 mL de água). A mistura foi mantida no escuro à temperatura ambiente, por 16 h. A seguir a mistura foi diluída até obter uma absorvância de 0,70 a 734 nm. Foram adicionados 33,0 µL do extrato (concentração 10.000 µg mL^-1) em uma cubeta contendo 3,0 mL do radical ABTS^.+. Para o controle positivo foram adicionados 33,0 µL de MeOH e 3,0 mL da solução do radical, enquanto que para o branco da amostra, adicionaram-se 3,0 mL de MeOH e 33,0 µL da solução do extrato. Foram realizadas as leituras a cada minuto em espectrofotômetro (Agilent Tecnologies, modelo Cary 60 UV-VIS) a 734 nm, durante 30 min. A atividade antioxidante foi expressa como porcentagem de inibição em relação ao controle positivo, de acordo com a equação (1).

Análise estatística

Os resultados apresentados foram obtidos por meio da média de três repetições ± desvio padrão e foram analisados estatisticamente pelo teste de Tukey (p<0,05), com comparações múltiplas. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o software Graph Pad InStat, Versão 3.02 (1998).

Resultados e Discussão

A secagem das folhas de P. major foi realizada nas temperaturas de 40, 60 e 80 °C, com tempos de secagem de 5,2; 2,1 e 1,5 h respectivamente, demonstrando que o aumento da temperatura proporcionou a aceleração do processo, o que reduziu o tempo de secagem. Os rendimentos foram respectivamente de 8,0%, 7,7% e 7,6%.

Os compostos fenólicos estão intimamente ligados à ação antioxidante em produtos naturais. Fatores como maturação, espécie, método de cultivo, origem geográfica, condições de colheita, processos de armazenamento e processamento, podem influenciar no teor destes compostos^[31]. O conteúdo de fenólicos totais dos extratos da tansagem está apresentado na TABELA 1.

O método espectrofotométrico utilizando o reagente Folin-Ciocalteu, consiste de uma mistura de cor amarela dos ácidos fosfomolibídico e fosfotunguístico em meio básico, no qual o molibdênio e o tungstênio encontram-se no estado de oxidação 6+. Na presença de agentes redutores forma-se um complexo molibdênio-tungstênio azul, no qual a média do estado de oxidação dos metais está entre 5+ e 6+. Este não é um método específico, pois detecta todos os grupos fenólicos presentes no extrato, incluindo aqueles presentes nas proteínas extraíveis e substâncias como ácido ascórbico^[32].

O teor de compostos fenólicos totais da tansagem revelou que o solvente EtOH/H₂O 70:30 v/v da secagem a 40 °C foi o mais eficiente na extração destes compostos. Comparando-se as temperaturas de secagem e os mesmos solventes extratores, a temperatura de 40 °C apresentou maior quantidade de compostos fenólicos para todos os solventes, ressaltando a influência da temperatura na estabilidade dos compostos fenólicos da tansagem. Comparando-se a eficiência dos solventes, EtOH/H₂O 70:30 v/v foi o mais eficiente para as temperaturas de 40 e 60 °C e MeOH/H₂O 95:5 v/v o mais eficiente para a temperatura de 80 °C. Diversos autores têm estudado o melhor método e solvente para a extração de compostos fenólicos de diferentes matrizes, sendo que a escolha mais apropriada varia de acordo com o objetivo de aplicação, gerando economia e eficiência no processo^[33,34].

A TABELA 2 apresenta os teores de flavonoides totais para os extratos da tansagem. As condições que apresentaram maior teor de flavonoides totais foram as extrações realizadas com os solventes MeOH/H₂O 95:5 v/v com a tansagem seca a 40 e 60 °C e EtOH/H₂O 95:5 v/v a 80 °C, não apresentado diferenças significativas entre seus valores. Observa-se que o aumento da temperatura de secagem foi pouco eficiente na degradação dos flavonoides em decorrência da diminuição do tempo de secagem. Nossos dados corroboram com os resultados reportados na literatura referente a secagem do taro^[35] e polpa de camu-camu^[36], nos quais foram observados que apesar de os flavonoides serem compostos termossensíveis, estão sujeitos a uma maior degradação quando submetidos a altas temperaturas por tempo prolongado.

A TABELA 3 apresenta a porcentagem de atividade antioxidante para os extratos da tansagem na concentração de 10.000 µg mL^-1 frente o radical DPPH nos tempos de 0, 5 e 30 min.

O comportamento cinético do composto pode ser classificado de acordo com o tempo de consumo de 50% do radical DPPH^. (TC₅₀). Quando TC₅₀ é menor que 5 min a cinética é classificada como rápida, intermediária se TC₅₀ está entre 5 e 30 min ou lenta quando TC₅₀ apresenta-se maior do que 30 min^[37].

O BHT e o ácido ascórbico na concentração de 100 μg mL^-1 foram utilizados como controle positivo (padrão) para a atividade antioxidante pelo método de sequestro do radical livre DPPH^.. O ácido ascórbico apresentou uma cinética rápida, inibindo 94,7% do radical em um tempo menor que 5 min, enquanto o BHT apresentou uma cinética lenta, inibindo 32,2% do radical DPPH em 30 min.

A análise dos dados da TABELA 3 revela que os extratos que apresentaram maior potencial antioxidante foram: a 40 ºC com os solventes EtOH/H₂O 95:5 e 70:30 e MeOH/H₂O 95:5; a 60 ºC com os solventes EtOH/H₂O 70:30 e MeOH/H₂O 95:5 e 70:30, não apresentando diferença significativa entre seus valores. Todos os extratos apresentaram cinética rápida e altos valores de porcentagem de atividade antioxidante. Para a secagem a 80 ºC os melhores resultados de atividade antioxidante foram para o solvente MeOH/H₂O 95:5 inibindo 92% do radical no tempo zero, e os demais solventes foram menos ativos, porém também com cinética rápida. Os extratos de tansagem apresentaram atividade antioxidante maior que o padrão BHT, e similar ao ácido ascórbico.

A TABELA 4 apresenta a porcentagem de atividade antioxidante para os extratos da tansagem na concentração de 1.000 µg mL^-1 frente o radical DPPH nos tempos de 0, 5 e 30 min.

Nesta concentração também foi possível verificar diferenças significativas (p>0,05) entre os extratos e temperaturas de secagem. Para a secagem a 40 ºC os solventes extratores que apresentaram maior potencial antioxidante foram o EtOH/H₂O 70:30 e MeOH/H₂O 95:5, não apresentando diferença significativa entre seus valores (p<0,05), com cinética rápida. Para a secagem a 60 ºC e 80 ºC o solvente MeOH/H₂O 70:30 foi o mais ativo.

O aumento da temperatura de secagem diminuiu o potencial antioxidante dos extratos, excetuando-se o MeOH/H₂O 70:30. Para as folhas da tansagem, a melhor resposta de sequestro do radical livre DPPH foi secando-as a 40 ºC e extraindo seus compostos bioativos com EtOH/H₂O 70:30 e MeOH/H₂O 95:5.

Os resultados demonstram a influência da concentração na atividade antioxidante, quanto maior a concentração, maior a atividade (TABELAS 3 e 4).

A interação de uma substância antioxidante com o DPPH^. depende, principalmente, de sua conformação estrutural e do número de grupos hidroxílicos disponíveis. Entretanto, para a maioria das substâncias testadas o mecanismo parece ser muito mais complexo, sendo necessários estudos mais aprofundados^[29].

Estudos demonstraram potencial antioxidante superior do extrato etanólico de P. major, quando comparado aos extratos preparados com água (quente e gelada), pelo método de sequestro do radical livre DPPH^[12]. Relatos sobre o potencial antioxidante do extrato metanólico da tansagem, sugerem que os compostos responsáveis por esta propriedade são provavelmente compostos fenólicos que possuem grupos hidroxila, e os flavonoides que possuem os mesmos grupos nas posições 3′, 4′ no anel B e/ou na posição C-3^[38].

Além disso, a ligação dupla C2-C3 conjugada com um grupo 4-ceto, é responsável pela deslocalização de elétrons do anel B, aumentando ainda mais a capacidade de eliminação de radicais livres e/ou sua remoção^[39,40]. A ausência dos grupos OH no anel B e, a presença de grupos OH nas posições 7 e 8 do anel A é capaz de compensar e tornar-se um maior determinante da atividade antirradicalar de flavonoides^[41]. Os flavonoides já isolados de P. major possuem essas características estruturais^[16], podendo ser os compostos responsáveis pelo alto potencial antioxidante da planta.

A TABELA 5 apresenta os resultados de atividade antioxidante dos diferentes extratos da tansagem na concentração de 10.000 µg mL^-1 determinada pelo método do sequestro do radical livre ABTS^.+.

Para as secagens a 40 e 80 ºC, no tempo de 30 min, não houve diferença significativa nos valores de atividade antioxidante para os diferentes solventes extratores. Para a secagem a 60 ºC o extrato MeOH:H₂O 70:30 foi o que demonstrou maior poder antioxidante. Os resultados de atividade antioxidante pelo método ABTS^.+, demonstram pouca influência da temperatura de secagem das folhas da tansagem e do solvente extrator. A cinética das reações quanto à captura do radical ABTS^.+ apresentou-se de rápida a intermediária em todas as condições testadas.

Nossos estudos colaboram para desenvolver formulações da tansagem que levem a uma melhor utilização da sua biomassa, direcionando estudos de identificação e quantificação dos componentes principais e de ensaios farmacológicos destes extratos.

Conclusão

Para as folhas de Plantago major os solventes extratores que forneceram melhores respostas de atividade antioxidante foram EtOH/H₂O 70:30 e MeOH/H₂O 95:5 preparados a partir das folhas secas a 40 ºC. O aumento da temperatura de secagem influenciou negativamente no potencial antioxidante dos extratos. Para a secagem a 40 ºC o extrato etanólico 70:30 foi o que apresentou maior conteúdo de fenóis e o metanólico 95:5 o que apresentou maior conteúdo de flavonoides, observando-se uma correlação positiva entre o conteúdo de fenóis totais e flavonoides com a atividade antioxidante da tansagem.

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