Isolamento de 4-hidroxifenil-6-cafeoil-β-L-glicosídeo e β-sitosterol e avaliação das atividades antibacteriana, antioxidante e tóxica sobre Artemia salina de Casearia javitensis

Química

http://dx.doi.org/10.5935/2446-4775.20160021

Isolamento de 4-hidroxifenil-6-cafeoil-β-L-glicosídeo e β-sitosterol e avaliação das atividades antibacteriana, antioxidante e tóxica sobre Artemia salina de Casearia javitensis

4-Hydroxyphenyl-6-caffeoyl-β-L-glycoside and β-sitosterol isolation and antibacterial, antioxidant activities and toxicity against Artemia salina by Casearia javitensis

Autores:
1FACHIN-ESPINAR, M. Teresa;
1SOUZA, Maria Carolina S.;
1NUNEZ, Cecilia Verônica*;
Instituições
1Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Coordenação de Tecnologia e Inovação, Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia, Manaus, AM, Brasil.
*Correspondência:
cecilia@inpa.gov.br

Resumo

No Brasil, especialmente na região Amazônica, existe uma grande biodiversidade de plantas que ainda não foram estudadas química e biologicamente. Assim, o presente trabalho tem como objetivo realizar o fracionamento cromatográfico e a avaliação biológica dos extratos hexânicos e metanólicos dos galhos e das folhas de Casearia javitensis, bem como das fases obtidas dos extratos metanólicos. Os extratos e fases foram avaliados para determinar o seu potencial antibacteriano, antioxidante (DPPH e Fe3+/fenantrolina) e de toxicidade sobre Artemia salina. Quanto à atividade antibacteriana pelo método de difusão em poço, os extratos hexânicos dos galhos e das folhas apresentaram atividade sobre Staphylococcus aureus, Corynebacterium glutamicum e Bacillus cereus e os extratos metanólicos de folhas e galhos sobre Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Serratia marcescens. A fase acetato de etila, obtida do extrato metanólico das folhas, apresentou potencial antibacteriano sobre Bacillus cereus com uma concentração inibitória mínima de 250 μg/mL e um alto potencial antioxidante, sendo isolado o 4-hidroxifenil-6-cafeoil-β-L-glicosídeo. O fracionamento do extrato hexânico das folhas permitiu o isolamento do b-sitosterol. Ambas as substâncias isoladas foram identificadas por meio da análise dos espectros de RMN de 1H e 13C e de espectrometria de massas. Este é o primeiro relato da substância 4-hidroxifenil-6-cafeoil-β-L-glicosídeo no gênero Casearia.

Palavras-chave:
Salicaceae.
2,2-difenil-1-picrilhidrazila.
Fe3+/fenantrolina.
Amazônia.
Biodiversidade.
Casearia javitensis.

Abstract

In Brazil, especially in the Amazon region, there is a great biodiversity of plant species which have not been studied chemical and biologically yet. Therefore, the aim of the present study was to perform chemical and biological studies of Casearia javitensis extracts and phases. The extracts and phases were essayed to determine their antibacterial and antioxidant activities (DPPH and Fe3+/phenanthroline) and toxicity against Artemia salina. The hexanic extract of branches and leaves showed activity against Corynebacterium glutamicum, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus bacteria. The methanolic extracts of leaves and branches were active against Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Serratia marcescens. The ethyl acetate phase obtained from methanol extracts of the leaves showed a minimum inhibitory concentration of 250 μg/mL to Bacillus cereus and a high antioxidant potential. Their fractionation yielded the substance 4-hydroxyphenyl-6-caffeoyl-β-L-glycoside. The fractionation of the hexane extract of leaves yielded the compound b-sitosterol. Both structures were identified by 1H and 13C-NMR analysis and mass spectrometry. This is the first report of the substance 4-hydroxyphenyl-6-caffeoyl-β-L-glycoside in Casearia genus.

Key-words:
Salicaceae.
2,2-difenil-1-picrilhidrazila.
Fe3+/fenantrolina.
Amazônia.
Biodiversity.
Casearia javitensis.

Introdução

O gênero Casearia pertencente à família Salicaceae, está representado por mais de 180 espécies descritas na literatura, das quais 70 encontram-se distribuídas no continente americano e 37 estão presentes no Brasil (MARQUETE, 2007). Na medicina popular, as espécies do gênero Casearia são utilizadas para o tratamento de infecções e mordeduras de cobras (PRIETO et al., 2013; SILVA et al., 2008).

Quimicamente são conhecidas pelo fato de apresentarem na sua composição química, vários diterpenos, triterpenos e ácidos hexanóicos e caproicos (PRIETO et. al., 2013; XIA et. al., 2015), sesquiterpenos e monoterpenos, bem como outras classes de metabólitos secundários, incluindo glicosídeos fenólicos e flavonoides (RAYANIL, NIMNOUN e TUNTIWACHWUTTIKU, 2012). Wyrepkowski (2010) relatou a presença de β-sitosterol, indícios do triterpeno friedelina e o esteroide campesterol. Barbosa (2015) mostrou que os extratos aquosos de folhas e galhos de Casearia javitensis tem potencial inseticida sobre Sitophilus zeamais.

Neste contexto, a espécie Casearia javitensis foi escolhida para a realização do estudo fitoquímico, bem como a avaliação das atividades antioxidante, antibacteriana e de toxicidade frente à Artemia salina.

Material e Métodos

Coleta e identificação do material vegetal

O material vegetal foi coletado em 16 de janeiro de 2013 na Reserva A. Ducke/INPA, localizado no Km 26 da rodovia AM-010, município de Manaus, AM. A exsicata do material vegetal foi depositada sob o número 259224 e identificada por especialistas no Herbário da Coordenação de Pesquisas em Botânica do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA.

Obtenção dos extratos vegetais

O material vegetal foi separado em folhas (261,00 g) e galhos (150,00 g), secos em estufa a 40°C e triturado em moinho de facas para o preparo dos extratos. O material seco e moído foi primeiramente extraído com hexano (2 L), usando ultrassom (UNIQUE, modelo USC-2800) por 20 min. Em seguida, o solvente foi filtrado e novamente extraído com hexano, sendo este procedimento repetido (totalizando 3 extrações). Após a extração com hexano, o material vegetal (torta) foi seco e extraído com metanol (MeOH, 2 L), também com auxílio de ultrassom por 20 min, filtrado e este procedimento repetido mais duas vezes. Os extratos filtrados foram concentrados utilizando evaporador rotativo (FISATOM, Modelo 802/Brasil), sob pressão reduzida, em temperatura <50°C, obtendo assim os extratos hexânico (2,63 g) e metanólico (15,24 g) das folhas e; hexânico (0,495 g) e metanólico (1,50 g) dos galhos.

Análises fitoquímicas

As análises iniciais dos extratos foram realizadas por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), empregando cromatofolhas de alumínio com sílica gel impregnado com indicador de fluorescência (UV254) (Alugram SIL G/UV254). As amostras foram aplicadas em cromatoplacas e eluídas com sistemas como: hexano/diclorometano (DCM) 1:1, DCM, hexano/acetato de etila 7:3 e 1:1, DCM/acetona 8:2 e 1:1 e acetato de etila/metanol 7:3, de acordo com a polaridade das amostras. Para a revelação das substâncias presentes nas placas cromatográficas foram utilizados: luz ultravioleta (λ: 254 e 365 nm), iodo ressublimado, sulfato cérico, cloreto férrico, cloreto de alumínio e anisaldeído sulfúrico. Os extratos metanólicos foram analisados usando como revelador também o DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila). Os extratos que tiveram atividade significativa no teste qualitativo foram submetidos à partição líquido-líquido, obtendo-se as fases: hexânica, em DCM, em acetato de etila (AcOEt) e hidroalcoólica, que foram posteriormente avaliadas por separado.

Fracionamento e isolamento

O extrato hexânico das folhas (1,02 g) foi submetido a fracionamento em coluna cromatográfica aberta de vidro (Vidrolabor, Labor-Quim/Brasil) de 41 x 3 cm utilizando como fase estacionária 100 g de Florisil (Sigma-Aldrich, 100-200mesh) e eluída em gradiente de hexano/acetona (9:1; 8,5:1,5; 8:2; 7,5:2,5; 7:3; 1:1), acetona e metanol o que rendeu 32 frações. Após análise por CCDC, as frações de 1 a 3 foram reunidas (0,047 g) e fracionadas em coluna de Florisil com os solventes hexano/DCM (9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 1:1; 3:7; 1:9), DCM, DCM/AcOEt (9:1; 7:3; 1:1), AcOEt, AcOEt/MeOH (9:1; 6:4) e MeOH, obtendo-se 79 frações. Destas as frações 32 a 43 foram reunidas (0,32 g) e fracionadas em coluna cromatográfica de vidro utilizando-se como fase estacionária alumina (Sigma, Grado: Super I, tipo: WN-6: Neutro) e sistema isocrático de hexano/AcOEt (1:1) como eluente, obtendo-se a fração 4 que continha a substância 1 (0,005 g).

O extrato metanólico das folhas (10,0 g) foi solubilizado inicialmente com uma mistura de MeOH/H2O (80:20) e submetido à partição líquido-líquido com hexano, DCM e AcOEt. A fase em AcOEt (0.30 g) foi fracionada em coluna de Sephadex LH-20 (Sigma) utilizando-se sistema isocrático de MeOH como eluente, obtendo-se 23 frações. Após a análise por CCDC, as frações 10 a 12 foram reunidas (0,03g) e fracionadas em coluna de Florisil com os solventes DCM/AcOEt (1:1; 3:7), AcOEt, AcOEt/acetona (9:1; 8:2; 7:3), acetona, obtendo-se 33 frações, sendo que a de número 18 (0,0015 g) continha a substância 2 em elevado grau de pureza.

As duas substâncias foram analisadas por Ressonância Magnética Nuclear de 1H de 300 MHz, dissolvidas em CDCl3.

Avaliação da atividade antibacteriana

Para os ensaios antibacterianos foram utilizadas tanto bactérias gram-positivas quanto gram-negativas de interesse clínico ou do agronegócio como: Aeromonas hydrophila (ATCC 7966), Bacillus cereus (ATCC 14579), Escherichia coli (ATCC 11775), Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032), Edwardsella tarda (ATCC 15947), Nocardia brasiliensis, Providencia rettgeri (ATCC 29944), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), Pseudomonas fluorescens (ATCC 13525), Salmonella enteritidis (ATCC 6051), Staphylococcus aureus (ATCC 12600)e Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883). A avaliação dos extratos e das frações foi realizada pelo método de difusão em Ágar por meio de difusão em poço, de acordo com as normas estabelecidas pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2002). Para isto, inicialmente os micro-organismos testes foram repicados em caldo Müeller-Hinton, sendo incubados durante um período de 16 a 24 horas, para a reativação.

A turbidez da cultura foi ajustada em caldo a uma concentração de 0,5 da escala de McFarland, o que equivale a uma suspensão bacteriana, contendo aproximadamente de 1 a 2 x 108 UFC/mL.

Em placas de Petri esterilizadas, foram adicionados 20 mL de ágar Müeller Hinton e, após a solidificação, a superfície seca foi inoculada com as bactérias teste. Em seguida, confeccionou-se poços/orifícios de 6,0 mm, colocando-se neles 50 μL do extrato a uma concentração de 1 mg/mL, e como controle positivo foram adicionados 50 μL de oxitetraciclina a uma concentração de 125 μg/mL. As placas foram incubadas em aerobiose a 30 ou 37°C por 18 h. Após esse período, foram observados os halos de inibição resultantes. Os diâmetros dos halos de inibição total (visualizados a olho nu) foram mensurados (mm), incluindo o diâmetro do poço usando uma régua.

A atividade antibacteriana também foi avaliada pelo método de micro diluição em caldo, seguindo orientações propostas por CLSI (2002). Os extratos e as frações foram primeiramente solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO) a 5%, e em seguida realizadas diluições sucessivas até a obtenção das concentrações de 1000 a 7,8 μg/mL.

Para a realização do ensaio, o inoculo foi previamente ajustado em espectrofotômetro, obtendo-se uma absorbância de 0,08 em 625 nm (o que equivale à escala 0,5 de McFarland), este então foi diluído 20 vezes. Assim, o volume final de bactéria aplicado em cada poço foi de aproximadamente 5 x 104 UFC.

Em seguida foram adicionados em cada um dos poços (microplaca de 96 poços) 5 μL desta solução de inoculo e 95 μL de cada concentração do extrato.

Para o controle negativo foram utilizados 95 μL de caldo Müeller Hinton contendo 5% de DMSO e 5 μL de inoculo. Para o controle positivo foram utilizados 95 μL do antibiótico oxitetraciclina na concentração de 125 μg/mL e 5 μL de inoculo.

Todos os testes foram realizados em triplicata. Em seguida, a placa foi incubada à temperatura e tempo adequados para cada micro-organismo (30 ou 37ºC). Cada microplaca foi avaliada através da leitura espectrofotométrica em 625 nm. Os dados obtidos foram processados utilizando-se o programa estatístico Origin8.

Atividade antioxidante

O potencial antioxidante dos extratos e das frações foi avaliado pelas metodologias quantitativas de DPPH e Fe3+/fenantrolina (MARTINS et al., 2014). Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados obtidos foram expressos em equivalência com o ácido ascórbico (antioxidante padrão).

Curvas de calibração com ácido ascórbico

Inicialmente foram preparadas as soluções de: DPPH (28 μg/mL), Fe3+, 1,10-fenantrolina 0,25% e uma solução de ácido ascórbico com água deionizada em uma concentração de 900 μg/mL a partir da qual foram preparadas diluições, resultando nas seguintes concentrações: 0, 90, 180, 360, 540 e 720 μg/mL. Para obtenção da curva de calibração com DPPH, 990 μL deste reagente foram adicionados em seis microtubos e mais 10 μL da solução de ácido ascórbico nas diferentes concentrações. Após 30 minutos foi realizada a leitura da absorbância em espectrofotômetro no comprimento de onda de 517 nm. Para a obtenção da curva de calibração de Fe3+/fenantrolina foram adicionados em seis novos microtubos 10 μL da solução de ácido ascórbico nas diferentes concentrações, mais 10 μL da solução padrão de Fe3+ e 980 μL da solução 1,10-fenantrolina 0,25%. Após 1 hora foi realizada a leitura da absorbância em espectrofotômetro no comprimento de onda de 508 nm.

Ensaio com 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH)

A avaliação quantitativa da atividade antioxidante dos extratos e das frações foi realizada utilizando o método com DPPH, o qual é considerado um radical estável que permite avaliar a capacidade de substâncias como sequestradoras de radicais, tendo sua absorção máxima no comprimento de onda de 517 nm. Quando o DPPH recebe um elétron ou um radical hidrogênio torna-se um composto mais estável e sua absorção diminui. Para determinação da absorbância da reação entre o DPPH e os extratos foram utilizados 990 μL de DPPH (28 μg/mL solubilizados em metanol) e 10 μL da solução de cada um dos extratos a uma concentração de 0,5 mg/mL, em triplicata. Como controle negativo, foram utilizados 990 μL de DPPH (28 μg/mL solubilizados em metanol) e 10 μL de metanol. Após 30 minutos, foi realizada a leitura da absorbância em espectrofotômetro no comprimento de onda de 517 nm.

Ensaio com Fe3+/fenantrolina

O complexo vermelho-alaranjado produzido pela reação entre Fe2+ (produzido pela ação antioxidante do agente em estudo sobre a redução de Fe3+) e 1,10-fenantrolina apresenta a sua absorbância máxima a 508 nm. Para avaliação da atividade antioxidante dos extratos foram utilizados 980 μL da solução de 1,10-fenantrolina e adicionados 10 μL da solução de Fe3+ e 10 μL da solução dos extratos a uma concentração de 0,5 mg/mL. Sendo utilizado a 1,10-fenantrolina como controle negativo. Todos os testes foram realizados em triplicata.

Ensaio de toxicidade sobre Artemia salina

O ensaio foi realizado seguindo a metodologia proposta por Meyer e colaboradores (1982). Foram utilizados para eclosão 10 mg de cistos de Artemia salina, os quais foram colocados numa solução salina (3,8%). As condições de crescimento utilizadas para a eclosão dos cistos foram de temperatura de 25 a 28°C e iluminação em lâmpada fluorescente durante 48 horas. Após o período de eclosão, as placas de 24 poços foram preenchidas com um total de 240 larvas, sendo estas distribuídas 10 larvas de A. salina para cada poço. Em cada placa, foram realizados os controles da solução salina, do solvente e o controle positivo (dicromato de potássio, 0,1%), todos em triplicata. Os extratos foram adicionados nos poços do teste, na concentração inicial de 500 μg/mL. As placas com as larvas de A. salina foram mantidas por 24 horas sob iluminação de lâmpada fluorescente. Após esse período, avaliou-se o número de larvas sobreviventes.

Resultados e Discussão

Análise fitoquímica

Os extratos hexânicos das folhas e galhos, assim como o extrato metanólico das folhas, quando submetidos à análise por CCDC mostraram a possível presença de terpenos ao serem revelados com Ce(SO4)2, pois apresentaram uma coloração lilás característica desta classe química. Observou-se também a presença de substâncias fluorescentes sob a luz UV indicando a presença de substâncias aromáticas. Os extratos metanólicos das folhas e galhos, assim como as frações destas quando revelados com DPPH mostraram a presença de possíveis antioxidantes, o que foi confirmado com os resultados obtidos através da análise quantitativa da atividade antioxidante.

A partir do fracionamento sucessivo realizado do extrato hexânico e metanólico das folhas de C. javitensis foi possível à obtenção de duas substâncias identificadas como b-sitosterol (1) e um fenol-glicosídeo denominado 4-hidroxifenil-6-cafeoil-β-L-glicosídeo (2).

A substância 1 obtida na forma de cristais, revelando coloração lilás com anisaldeído e eluída em hexano/AcOEt (1:1) e fator de retenção (Rf) de 0,63, foi identificada através da análise dos espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H o qual mostra sinais característicos desta substância, quando comparados com os dados na literatura (ARAGÃO et al., 1990), observando-se uma concentração de sinais com deslocamentos químicos (δH) entre 0,67 e 1,0 ppm correspondentes às metilas presentes neste composto, assim como vários sinais entre δH 1,1 e 2,3 ppm correspondentes aos hidrogênios metilênicos. Também foram observados um dl com deslocamento em δH 5,3 ppm (J = 5,3 Hz) e m em δH 3,5 ppm, sendo estes sinais correspondentes ao hidrogênio olefínico (H-5) e ao hidrogênio carbinólico (H-3), respectivamente. O β-sitosterol é um dos esteroides comumente encontrados em várias espécies de Casearia (WANG et al., 2009).

A substância 2 foi isolada como cristais, apresentando Rf de 0,50 quando eluída em AcOEt/acetona (8:2), revelada coloração azul escuro com FeCl3 e foi identificada pela análise dos espectros de RMN de 1H e gCOSY (gradient-selected correlation spectroscopy), e comparada com os dados da literatura (RAJU et al., 2010; LIU et al., 2013) os quais estão mostrados na (TABELA 1) e (FIGURA 1). O espectro de RMN de 1H mostrou os sinais correspondentes aos hidrogênios ligados em dois anéis benzênicos substituídos, um anel dissubstituído na posição para, caracterizado pela presença de quatro hidrogênios com deslocamentos químicos em δH 6,94 (2H, dd, J = 6,7; 2 Hz, H- 2, 6) e 6,64 (2H, dd, J = 6,7; 2 Hz, H-3, 5) e um segundo anel aromático trissubstituído na posição para e meta, sendo observados três hidrogênios em δH 6,79 (1H, d, J = 8,2 Hz, H-2"), 6,95 (1H, dd, J = 8,2; 2 Hz, H-3"), 7,06 (1H, d, J = 2 Hz, H-5"). Também foram observados sinais da presença de uma dupla ligação trans em δH 7,57 (1H, d, J = 16 Hz, H-7") e 6,30 (1H, d, J = 16 Hz, H-8"). Os demais sinais foram atribuídos ao açúcar presente com sinais em δH desde 3,52 até 5,07 ppm (hidrogênio anomérico). Os dados do espectro de massas de alta resolução tipo Ion trap, utilizando o modo positivo e negativo, determinou a massa molecular em 434 m/z, condizente com a fórmula molecular C21H22O10.

A substância 4-hidroxifenil-6-cafeoil-β-L-glicosídeo (2) está sendo descrita pela primeira vez no gênero Casearia, porém esta molécula já foi isolada de Vitex leucoxylon (Lamiaceae) (RAJU et al., 2010). Esta substância é um fenil-glicosídeo, classe química característica de espécies pertencentes à família Salicaceae, o que corrobora a nova classificação botânica (MOSADDIK et al., 2006; LIU et al., 2013; BELYANIN, STEPANOVA e OGORODNIKOV, 2012).

FIGURA 1. Estrutura química da 4-hidroxifenil-6-cafeoil-β-L-glicosídeo (substância 2) e correlações observadas no espectro bidimensional de RMN 1H x 1H (gCOSY).
FIGURA 1
TABELA 1. Dados de RMN de 1H de 4-hidroxifenil-6-cafeoil-β-L-glicosídeo, em CD3OD e comparação com a literatura (RAJU et al., 2010).
Posição 1H multiplicidade
(300 MHz para 1H)
1H multiplicidade
(600 MHz para 1H)
1 - -
2 6,94 (2H, dd, J = 6,7; 2 Hz) 6,94 (2H, d, J = 9 Hz)
3 6,64 (2H, dd, J = 6,7; 2 Hz) 6,65 (2H, d, J = 9 Hz)
4 - -
5 6,64 (2H, dd, J = 6,7; 2 Hz) 6,65 (2H, d, J = 9 Hz)
6 6,94 (2H, dd, J = 6,7; 2 Hz) 6,94 (2H, d, J = 9 Hz)
1' 5,07 (1H, d, J = 7,64 Hz) 4,74 (1H, d, J = 7,2 Hz)
2' 4,10 (1H, d, J = 7,64 Hz) 3,41 – 3,51 (3H, m)
3' 3,52 – 3,61 (m) 3,41 – 3,51 (3H, m)
4' 3,52 – 3,61 (m) 3,41 – 3,51 (3H, m)
5' 3,52 – 3,61 (m) 3,65 (1H, m)
6' 4,50 (1H, d, J = 12 Hz)
4,32 (1H, dd, J = 12; 6,7 Hz)
4,52 (1H, dd, J = 12; 2,4 Hz)
4,35 (1H, dd, J = 12; 7,2 Hz)
1" - -
2" 6,79 (1H, d, J = 8,2 Hz) 6,78 (1H, d, J = 8,4 Hz)
3" 6,95 (1H, dd, J = 8,2; 2 Hz) 6,92 (1H, dd, J = 8,4; 1,8 Hz)
4" - -
5" 7,06 (1H, d, J = 2 Hz) 7,05 (1H, d, J = 1,8 Hz)
6" - -
7" 7,57 (1H, d, J = 16 Hz) 7,56 (1H, d, J = 15,6 Hz)
8" 6,30 (1H, d, J = 16 Hz) 6,27 (1H, d, J = 15,6 Hz)
9" - -

Avaliação da atividade antibacteriana

Na (TABELA 2) estão mostrados os resultados dos halos de inibição obtidos para os extratos e as fases de C. javitensis avaliados. Os diâmetros dos halos de inibição foram comparados com a escala de atividade antimicrobiana adotada no laboratório (TABELA 3), baseada em Alves (2008). Os extratos hexânicos dos galhos apresentaram halos de inibição de 2,2 cm frente a C. glutamicum e de 2,4 cm frente à S. aureus, sendo considerados muito ativos. Os extratos hexânicos das folhas e galhos foram ativos frente à bactéria B. cereus com halos de inibição de 1,6 e 1,8 cm, respectivamente. Para os extratos metanólicos dos galhos e das folhas, os halos de inibição frente às bactérias P. aeruginosa e S. aureus foram de 1,1 cm para ambos os extratos, e o extrato metanólico das folhas apresentou atividade antibacteriana frente à S. marcences com halo de inibição de 1,2 cm, sendo, portanto, considerados com atividade moderada.

TABELA 2. Halos de inibição obtidos para os extratos e as fases de C. javitensis, pelo método de difusão em poço.
Partes da planta Extratos e Fases Bacillus cereus Corynebacterium glutamicum Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Serratia marcences
Galhos Hexano 1,8 cm 2,2 cm - 2,4 cm -
Galhos MeOH - - 1,2 cm 1,1 cm -
Galhos MeOH - Fase DCM 1,0 cm 1,3 cm 1,1 cm 1,5 cm -
Galhos MeOH - Fase AcOEt 1,8 cm - 0,9 cm 1,1 cm 1,1 cm
Folhas Hexano 1,6 cm - - - -
Folhas MeOH 1,0 cm - 1,1 cm 1,1 cm 1,2 cm
Folhas MeOH - Fase DCM 1,0 cm 1,0 cm 0,9 cm 0,9 cm -
Folhas MeOH - Fase AcOEt 1,3 cm 1,1 cm 1,9 cm 1,6 cm 1,1 cm
Folhas MeOH - Fase MeOH/H2O 0,8 cm 1 cm 1,1 cm 1,1 cm 0,9 cm
Controle positivo* 2,7 cm 2,4 cm 1,1 cm 2,8 cm 1,1 cm
*O controle positivo utilizado foi oxitetraciclina a uma concentração de 125 μg/mL. Concentração dos extratos e das fases de 1 mg/mL. Os halos de inibição foram medidos, incluindo o diâmetro do poço.
TABELA 3. Escala para interpretação dos resultados da atividade antibacteriana (ALVES, 2008).
Tamanho do halo de inibição Escala de comparação
Menor que 0,89 cm Inativo
Entre 0,90 e 1,29 cm Atividade moderada
Entre 1,30 e 1,79 cm Ativo
Maior que 1,80 cm Muito ativo

Por meio dos resultados obtidos foram observados que os extratos hexânicos de folhas e galhos apresentaram atividade antibacteriana somente frente às bactérias gram-positivas, já os extratos metanólicos apresentaram atividade frente às bactérias gram-positivas e gram-negativas. Silva e colaboradores (2008) demonstraram que substâncias presentes nos extratos etanólicos das folhas de C. sylvestris apresentaram importante atividade antibacteriana frente a ambos os tipos de bactérias, sendo as bactérias gram-positivas as mais sensíveis a esses extratos. Estudos realizados por Mosaddik e colaboradores (2004) demonstraram através de ensaios de concentração mínima inibitória, que espécies de C. multinervosa e C. grayi apresentam uma alta atividade antibacteriana frente à S. aureus.

Para determinação da concentração inibitória mínima, os extratos e as fases foram avaliados nos micro-organismos para os quais haviam apresentado atividade no ensaio de difusão em poço. Assim, os extratos hexânicos dos galhos e das folhas foram testados frente a B. cereus e S. aureus, a fase diclorometânica obtida a partir do extrato metanólico dos galhos frente a S. aureus; a fase acetato de etila obtida a partir do extrato metanólico dos galhos foi testada frente a B. cereus ea fase acetato de etila, obtida a partir do extrato metanólico das folhas, foi testada frente a B. cereus, P. aeruginosa e S. aureus. Destes, a fase mais ativa foi à fase acetato de etila, obtida a partir do extrato metanólico das folhas, que apresentou uma porcentagem de inibição de 75% do crescimento bacteriano até a concentração de 250 μg/mL, conforme (GRÁFICO 1).

GRÁFICO 1. Valores obtidos para o crescimento bacteriano (média e desvio padrão) em diferentes concentrações para a fase acetato de etila obtida a partir do extrato metanólico das folhas de C. javitensis frente a B. cereus.
GRÁFICO 1

Já os demais extratos e fases testadas pelo método de microdiluição não apresentaram porcentagens de inibição significativas quando comparados com o controle positivo.

Atividade antioxidante

A avaliação da atividade antioxidante foi realizada medindo a capacidade de sequestro de radicais livres do DPPH e de redução de Fe3+. Os resultados obtidos foram expressos em equivalência com o ácido ascórbico (TABELA 4) e interpretados conforme a escala apresentada (TABELA 5).

TABELA 4. Resultados da avaliação da capacidade antioxidante de extratos e fases de C. javitensis obtidos pelas metodologias de DPPH e Fe3+/fenantrolina.
Parte da planta Extrato/fase Ensaio com DPPH Ensaio com Fe3+/fenantrolina
Valores médios Valores médios
|ΔABS517| [AA]eq Equiv. (mg de extrato/mg de ácido ascórbico) |ΔABS508| [AA]eq Equiv. (mg de extrato/mg de ácido ascórbico)
Galhos Hexano 0,115 ± 0.027 0,989 ± 0.215 5,204 ± 1.016 0,059 ± 0.015 0,126 ± 0.024 40,684 ± 8.038
Galhos MeOH 0,610 ± 0.059 4,898 ± 0.467 1,027 ± 0.097 2,025 ± 0.298 3,503 ± 0.482 1,447 ± 0.217
Folhas Hexano 0,116 ± 0.002 1,002 ± 0.012 4,991 ± 0.060 0,062 ± 0.013 0,322 ± 0.022 15,589 ± 1.013
Folhas MeOH 0,610 ± 0.008 4,895 ± 0.060 1,022 ± 0.013 2,050 ± 0.278 3,543 ± 0.450 1,427 ± 0.193
Folhas MeOH - Fase diclorometânica 0,106 ± 0.011 0,781 ± 0.097 6,466 ± 0.788 0,570 ± 0.037 0,893 ± 0.063 5,619 ± 0.386
Folhas MeOH - Fase em acetato de etila 0,550 ± 0.010 4,666 ± 0.088 1,072 ± 0.020 2,704 ± 0.101 3,984 ± 0.146 1,256 ± 0.047
Folhas MeOH - Fase hidrometanólica 0,262 ± 0.018 2,242 ± 0.153 2,237 ± 0.158 0,899 ± 0.230 1,360 ± 0.334 3,857 ± 1.102
TABELA 5. Escala para interpretação dos resultados da atividade antioxidante (MARTINS et al., 2014).
Análise da atividade antioxidante (mg de extrato/mg de ácido ascórbico) Escala de comparação
Menor que 0,99 Muito ativo
Entre 1,0 e 1,99 Ativo
Entre 2,0 e 2,99 Atividade moderada
Maior que 3,0 Inativo

Os resultados obtidos nos ensaios quantitativos mostraram que os extratos metanólicos dos galhos e folhas possuem um alto potencial antioxidante (TABELA 4), visto que a equivalência com ácido ascórbico foi observada no intervalo de 1-1,99 (ativo). Por tal motivo esses extratos foram submetidos a uma partição líquido-líquido e avaliados, observando-se que a fase acetato de etila do extrato metanólico das folhas apresentou um alto potencial antioxidante de 1-1,99.

Esses resultados confirmam o observado na análise em CCDC, onde se verificou o potencial antioxidante qualitativo com DPPH. O reagente FeCl3 revelou a presença de substâncias aromáticas, na amostra analisada, sendo que a intensidade da coloração foi mais evidente na fase acetato de etila obtida do extrato metanólico das folhas. Resultados similares foram relatados numa triagem realizada para avaliar o potencial antioxidante dos extratos metanólicos de quatro espécies de Casearia pela metodologia de ABTS (MOSADDIK et al., 2004), o que evidencia que as espécies deste gênero possuem um alto potencial como antioxidantes in vitro.

Estudos realizados por Raju e colaboradores (2010) demonstraram, através da metodologia do DPPH, que a substância 4-hidroxifenil-6-cafeoil-β-L-glicosídeo possui uma importante capacidade antioxidante, sendo esta superior à apresentada pelos antioxidantes comerciais como BHT (di-tert-butil-hidroxitolueno) e o ácido ascórbico.

Os extratos hexânicos de folhas e galhos, assim como as fases diclorometânicas dos extratos metanólicos não apresentaram atividade antioxidante para ambas as metodologias utilizadas. Este resultado pode ser devido ao fato de que nos extratos vegetais as moléculas com maior atividade antioxidante são as substâncias fenólicas, os quais se encontram principalmente nos extratos metanólicos (DEWICK, 2002). E indica também que estes extratos não possuem carotenoides, que são as substâncias apolares que também costumam ter atividade antioxidante.

Toxicidade frente à Artemia salina

Os extratos e as fases de C. javitensis foram testados para avaliar o seu potencial tóxico frente às larvas de Artemia salina na concentração inicial de 500 μg/mL. Nesta concentração, os extratos e as fases avaliados não apresentaram atividade tóxica (TABELA 6), por esse motivo não foram avaliados em concentrações menores.

O extrato hexânico das folhas apresentou uma taxa de mortalidade de 23% das larvas de A. salina, sendo o maior valor observado entre os extratos e as fases testadas. O valor para um extrato ser considerado como tóxico é de 50% de mortalidade das larvas na concentração de 500 μg/mL. Os resultados obtidos mostraram que nenhum dos extratos foi considerado tóxico (LAGARTO et al., 2001).

TABELA 6. Resultados da porcentagem de toxicidade dos extratos de C. javitensis.
Parte vegetal Extrato/fase Mortalidade (%)
Galhos Hexano 20
Galhos MeOH 20
Folhas Hexano 23
Folhas MeOH - Fase acetato de etila 10
Folhas MeOH - Fase diclorometânica 7

Conclusão

O estudo fitoquímico das folhas de C. javitensis permitiu o isolamento de duas substâncias, o 4-hidroxifenil-6-cafeoil-β-L-glicosídeo (um fenil-glicosídeo) e o b-sitosterol (um esteroide). O fenil-glicosídeo está sendo relatado pela primeira vez no gênero, o que contribui com os conhecimentos sobre a composição química desta espécie.

As análises em CCDC mostram que os extratos hexânicos e metanólicos são potencial fonte de terpenos.

A avaliação da atividade antibacteriana pelo método de difusão em poço, do extrato hexânico dos galhos apresentou uma alta atividade frente às bactérias Corynebacterium glutamicum e Staphylococus aureus. Já os extratos hexânicos das folhas e dos galhos foram ativos sobre Bacillus cereus. Os extratos metanólicos de folhas e galhos foram ativos frente às bactérias Pseudomonas aeruginosa e Staphylococus aureus, enquanto a fase obtida a partir do extrato metanólico das folhas foi ativo sobre B. cereus, quando testado pelo método de microdiluição em caldo.

Quando analisados quanto a sua toxicidade frente A. salina, nenhum dos extratos testados foi tóxico.

Os extratos metanólicos das folhas e dos galhos e a fase acetato de etila obtida do extrato metanólico das folhas apresentaram atividade antioxidante. O fracionamento dessa fase acetato de etila permitiu o isolamento da substância 4-hidroxifenil-6-cafeoil-β-L-glicosídeo que possui atividade antioxidante relatada na literatura.

Com base nos resultados obtidos nas atividades antibacterianas e antioxidantes, a espécie em questão apresenta um forte potencial como fonte de substâncias bioativas, portanto o fracionamento dos extratos ativos continuará com a finalidade de obter outras substâncias que, também, possam ser responsáveis por essas atividades, ou que contribuam parcialmente com ela.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq (projetos PPBio/CNPq, REPENSA/CNPq, CT-Agro/CNPq, CT-Amazônia/CNPq) e CAPES (projeto Pro-Amazônia/CAPES) pelo apoio financeiro e pelas bolsas concedidas.

Conflito de Interesse

Os autores declaram não haver conflito de interesse.

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Histórico do artigo

Submissão:
10/03/2016
Aceite:
26/06/2016
Publicação:
23/02/2017

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