Otimização da extração de compostos fenólicos do resíduo agroindustrial de Cupuaçu (Theobroma grandiflorum (Wild. ex. spreng) K. Schum) da amazônia

Resumo

A Amazônia possui uma grande diversidade de frutas comestíveis, que dá origem a diversos produtos alimentícios. Essa exploração comercial gera uma quantidade significativa de resíduos, que possuem um potencial com atividade biológica, devido conter compostos fenólicos em suas matrizes. Assim, este estudo teve como objetivo empregar a metodologia de superfície de resposta para otimizar as concentrações de etanol (X1 = 25 a 75%) e a proporção solvente:soluto (X2: 30 a 90%) na recuperação de compostos fenólicos (CFT) a partir de resíduos agroindustrias de cupuaçu. O tempo do processo foi fixo em 1 h de extração a 37°C usando o banho por ultrassom assistido. Os resultados sugeriram que as condições ótimas foram concentração de etanol 50% e proporção de soluto: solvente foi de 1:100. Nas condições ótimas, o CFT experimental foi de 18,08 ± 2,37 µg GAE/ mg de casca de cupuaçu seca (CCS), que foi muito próximo ao valor predito. O modelo polinomial de segunda ordem ajustou satisfatoriamente aos dados experimentais com R ² ajustado de 89,70, implicando em uma boa concordância entre os valores preditos e experimentais, o que indica aceitabilidade na otimização das condições de extração de CFT da casca de cupuaçu.

Palavras-chave:

Resíduos.

Oeste do Pará.

Compostos bioativos.

DCCR.

Abstract

The Amazon has a great diversity of edible fruits, which originate several food products. This commercial exploitation generates a necessary amount of waste, which has a potential for biological activity, as it contains phenolic compounds in matrices. Thus, this study aimed to employ the response surface methodology to optimize the treatment of ethanol (X1 = 25 to 75%) and the solvent: solute ratio (X2: 30 to 90%) in the recovery of phenolic compounds (CFT) to from agribusiness residues from cupuaçu. Process time was fixed at 1 h of extraction at 37°C using the assisted ultrasound bath. The results suggested that the optimal conditions were 50% ethanol concentration and the solute:solvent ratio was 1:100. Under the optimal conditions, the experimental CFT was 18.08 ± 2.37 µg GAE / mg of dry cupuaçu peel, which was very close to the predicted value. The second order polynomial model fits the experimental data satisfactorily with an adapted R2 of 89.70, implying a good agreement between the predicted and experimental values, which indicates acceptability in the optimization of the conditions for the extraction of CFT from the cupuaçu peel.

Keywords:

Waste.

Western Pará.

Bioactive compounds.

DCCR.

Introdução

A Amazônia é mundialmente conhecida pela biodiversidade de sua flora. Foram descritas cerca de 250 espécies de frutos comestíveis na região, entre eles o Theobroma grandiflorum (Wild. ex.spreng) K.Schum (cupuaçu)^[1] , o qual pertence à família Malvaceae e tem ganhado destaque no cenário nacional e internacional, devido possuírem alto teor em gordura, valor nutricional e baixo custo, movimentando a economia da região com a produção de polpas, sucos, sorvetes e doces^{[2, 3]}. Outra vertente da exploração desse fruto, que está em ascensão, é a fabricação de cosméticos e fitofármacos, que tem voltado os olhares atentos de pesquisadores para geração de novos produtos e tecnologias a partir dessa matéria-prima^[4].

A exploração comercial desses frutos gera expressivas quantidades de resíduos. Apenas a polpa e as amêndoas tem uso industrial o que provoca aumento da produção de lixo orgânico oriundo do processamento desses frutos, causando impactos ambientais em decorrência do descarte incorreto desses materiais^{[5- 7]}. A conduta mais geral adotada por algumas empresas é empregá-los como adubo orgânico, porém, estudos promissores mostram que esse resíduo possui significativos teores nutricionais, destacando-se o potássio, ferro, selênio e antioxidantes, este último possuindo a capacidade de retardar o processo de degeneração celular^{[8- 10]}.

São escassos os estudos com foco nos resíduos gerados a partir da exploração comercial de recursos naturais, dentro desse contexto, os resíduos de T. grandiflorum , poderiam ser utilizados tanto na indústria alimentícia, na composição de rações e alimentos funcionais, quanto na indústria farmacêutica, por possuírem compostos bioativos como os fenólicos, que são associados ao tratamento clínico de certas patologias^{[11- 13]} , possibilitando um emprego econômico-sócio-ambiental mais eficiente para esse subproduto.

Levando em consideração o potencial biológico e consequentemente a presença de compostos fenólicos nesses resíduos, há uma necessidade de explorar a extração destes para uma possível aplicação. Para isso, torna-se necessário estudar o efeito, seja positivo ou negativo, de cada parâmetro que se deseja avaliar, o qual é específico para cada material, devido às diferenças nas propriedades físico-químicas e morfológicas dos vegetais. Sendo assim, um protocolo universal de extração não é aceitável e um processo de extração deve ser desenvolvido e otimizado para cada fonte de compostos fenólicos^[14]. Com base nesses conhecimentos, o objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos parâmetros de extração na obtenção de extrato rico em compostos fenólicos a partir da casca de cupuaçu.

Material e Métodos

Obtenção e preparo da matéria-prima

Os resíduos agroindustriais de cupuaçu (RAC), provindos da extração de polpas de fruta, foram doados pela Cooperativa dos Produtores Rurais de Santarém (COOPRUSAN), localizada no município de Santarém, Pará - Brasil. Os resíduos foram secos em estufa com circulação de ar a 40°C por 48 horas e transformados em farinha, através da trituração do resíduo seco em moinho de faca e homogeneizados em peneira com abertura de 28 mesh (0,6 mm). A farinha obtida foi acondicionada e identificada em embalagens de polietileno e armazenada em freezer a -40ºC até o momento das extrações.

Processo de extração dos compostos fenólicos

A extração dos compostos fenólicos presentes no RAC foi realizada por meio do método de extração assistida por ultrassom, no qual foram utilizadas soluções hidroetanólicas. A extração foi realizada em erlenmeyer, misturando a farinha de resíduo seco de cupuaçu (FRC) a diferentes concentrações de etanol (30 a 90% v/v, etanol: água) e diferentes razões soluto: solvente (1:25 a 1:75 m/v) conforme o planejamento experimental (TABELA 1) em um banho ultrassônico (Solidsteel, modelo SSBu - 10 L; potência fixa de 160 Watts e frequência fixa de 40 KHz) a 35°C por 60 minutos. Após a extração, as amostras foram filtradas em papel de filtro qualitativo Whatman n° 1 com auxílio de bomba a vácuo, e armazenadas em freezer a - 40ºC até o momento da análise.

Otimização dos parâmetros de extração

A extração dos compostos fenólicos totais (CFT) foi otimizada estudando o efeito da aplicação de diferentes concentrações de etanol e água (% v/v, variável independente X1) e da razão soluto: solvente (m/v, variável independente X2) por meio de um planejamento composto central rotacional (DCCR) 2² , contendo 4 pontos fatoriais, 4 pontos axiais e 3 repetições no ponto central, totalizando 11 ensaios, como apresentados na TABELA 1. As faixas de variação entre o limite inferior e o superior de cada variável independente foram estabelecidas de acordo com testes realizados antes dos ensaios.

Os experimentos foram conduzidos de forma aleatória e os dados foram analisados por meio de múltiplas regressões usando o método dos quadrados mínimos. A função resposta (CFT) foi dividida em componentes linear, quadrático e a interação, e os dados foram ajustados a um modelo polinomial de segunda ordem, através da equação: , onde Y é a resposta predita (CFT); β ₀ é o intercepto; βi , βii e βij são os coeficientes do modelo (linear, quadrático e interação); e xi e xj são os níveis codificados das variáveis independentes. A partir do modelo ajustado, foram gerados gráficos de superfície resposta tridimensionais e gráficos de contorno para visualizar a relação entre a resposta e os níveis de cada fator e deduzir as condições ótimas.

Determinação de fenólicos totais

Para a quantificação dos fenólicos totais foi utilizado o método de Folin-Ciocalteau^[15]. O ensaio foi realizado adicionando 0,5 ml da amostra e 2,5 ml do reagente folin-ciocalteau 5% em tubo de ensaio. Após 5 minutos foram adicionados 2,0 ml de carbonato de sódio 4% e as amostras foram homogeneizadas em agitador de tubo e mantidas em ausência de luz durante 2 horas. Após este período foram realizadas as leituras a 740 nm em espectrofotômetro LGI SCIENTIFIC. Foi realizado um branco, utilizando água destilada no lugar da amostra e os ensaios foram realizados em triplicata. Os resultados foram calculados a partir de uma curva padrão de ácido gálico e expresso em microgramas equivalentes de ácido gálico (EAG) por miligrama de amostra (µg EAG/mg de amostra).

Determinação de flavonoides totais

A determinação dos flavonoides totais foi realizada de acordo com Zhishen^[16] com modificações. O ensaio constituiu da adição de 0,6 mL de amostra e 2,4 mL de solução cloreto de alumínio 0,1% em tubo de ensaio e mantido por 30 min a temperatura ambiente e na ausência de luz. Após este período, a leitura foi realizada em espectrofotômetro a 420 nm. O resultado foi calculado a partir de uma curva padrão de rutina e expresso em micrograma de equivalente de rutina (ER) por miligrama de amostra.

Determinação de taninos condensados

Os taninos condensados foram determinados de acordo com Salgado et al.^[17]. Para a reação foram adicionados em um tubo de ensaio 0,25 mL de amostra, 1,5 mL de vanilina 4% em metanol, e 0,75 mL de ácido clorídrico concentrado. A mistura reacional permaneceu em repouso por 15 minutos a temperatura ambiente e na ausência de luz. Após este período, a leitura foi realizada em espectrofotômetro a 500 nm. O resultado foi calculado a partir de uma curva padrão de catequina e expresso em micrograma de equivalente de catequina por miligrama de amostra.

Determinação da atividade antioxidante pelo método de sequestro do radical DPPH

A análise pelo método de sequestro do radical DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhidrazil) foi realizada de acordo com Brand-Williams et al.^[18] , com algumas modificações. A mistura reacional foi composta pela adição de 2,4 ml de solução etanólica de DPPH (29 μg/ml) e 0,6 ml de extrato. A mistura reacional foi homogeneizada e as leituras realizadas em espectrofotômetro a 516 nm até a absorbância se manter constante. Os resultados foram calculados a partir de uma curva analítica de Trolox (±) -6-Hidroxi-2,5,7,8tetrametilcromano-2-ácido carboxílico) e expresso em μmol ET.mg-1 de amostra seca.

Determinação da atividade antioxidante pelo método de sequestro do radical ABTS

A capacidade antioxidante pelo método de captura do radical ABTS (2,2́-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)) foi determinada conforme metodologia descrita por Rufino et al.^[19]. A solução estoque do radical ABTS foi composta por 7 mM de ABTS com 140 mM de persulfato de potássio diluído em água e a mistura foi mantida na ausência de luz e em temperatura ambiente por 16 h. A solução estoque foi diluída em álcool etílico até se obter uma absorbância de 0,80 ± 0,05 a 734 nm. Para o ensaio, a reação foi composta por 15 μL de amostra e 1500 μL da solução de ABTS e a leitura realizada em espectrofotômetro a 734 nm após 6 min de reação. Os resultados foram calculados a partir de uma curva analítica de Trolox ((±) -6-Hidroxi-2,5,7,8tetrametilcromano-2-ácido carboxílico) e expresso em μmol ET.mg-1 de amostra seca.

Resultados e Discussão

A extração dos compostos fenólicos em matriz vegetal por ultrassom assistida ocorre por ruptura na parede celular e liberação destes compostos. Assim, para avaliar a melhor condição da extração dos compostos fenólicos da farinha do resíduo de cupuaçu, foi aplicada a técnica estatística baseada no emprego de planejamentos fatoriais denominada de planejamento experimental do tipo de planejamento rotacional central (DCCR), a fim de avaliar o efeito das variáveis estudadas. Os resultados demonstraram que a extração foi influenciada tanto pela concentração do solvente como pela proporção soluto: solvente no processo por ultrassom assistida, utilizando a temperatura de 37°C por 1 hora. Os valores experimentais obtidos estão na TABELA 1.

Os resultados mostraram que o teor dos CFT variou de 6,26 a 19,0 µg GAE/mg de farinha de casca de cupuaçu, sendo o valor mínimo obtido no ensaio 7 (50% de etanol v/v; 1 de soluto para 18 de solvente m/v) e o maior valor obtido no experimento 8 (etanol 50% v/v; 1 de soluto para 102 de solvente m/v). Os dados experimentais foram ajustados a uma modelo polinomial de segunda ordem e os coeficientes de regressão foram calculados (TABELA 2).

A tabela dos efeitos, juntamente com a ANOVA (TABELA 3), indica que o efeito quadrático de segunda ordem foi significativo (p ≤ 0,05) apenas para a concentração de etanol (X1) e o efeito linear de primeira ordem foi significativo (p ≤ 0,05) para a proporção soluto: solvente (X2), enquanto o efeito de interação das variáveis (X1*X2) não foi significativo.

A equação da regressão em nível codificado retirando os efeitos insignificantes foi gerada (modelo reparametrizado), obtendo a seguinte equação:

Z = 13,24 - 2,33X1² + 4,29X2

O resultado do ajuste do modelo polinomial de segunda ordem reduzido é apresentado na TABELA 3. A ANOVA mostrou que o modelo foi altamente significativo (p < 0,0000), obtendo um bom ajuste e aceitável para prever com precisão as variações, devido a não significância da falta de ajuste. Além disso, com base no valor de R² observa-se que o modelo pode explicar uma variação de 89,7%. Assim, os resultados indicam que o modelo obtido foi adequadamente ajustado aos dados experimentais, podendo ser utilizado para predizer o CFT em diferentes condições de extração estudadas.

Para investigar os efeitos de interação entre as variáveis na extração de CFT, foi gerado um gráfico de superfície de resposta (FIGURA 1). A análise indicou que existe uma faixa ideal de concentração de etanol para a máxima recuperação de CFT, devido ao efeito quadrático negativo e significativo apresentado por essa variável. Um aumento no teor de CFT foi observado com a elevação na concentração de etanol na faixa de 37,5 a 62,5%, sendo que a partir dessa concentração verificou-se um decréscimo no CFT (62,5 a 85% v/v).

A proporção soluto: solvente apresentou apenas efeito linear positivo e significativo, indicando que um aumento na proporção de solvente em relação ao soluto promove aumento proporcional na extração dos CFT da casca de cupuaçu, conforme observado na FIGURA 1.

A análise dos valores ótimos para os parâmetros investigados foi realizada pela metodologia de otimização simultânea, empregando-se a função de desejabilidade conforme a FIGURA 2.

A concentração de etanol foi igual a 50% (valor codificado = 0) e a proporção da amostra em relação ao solvente foi 1:102 (m/v), como valores apontados pela função de desejabilidade como os que fornecem melhor razão sinal/ruído (nesse caso, igual a 19,311) e a desejabilidade global igual a 1,00. A partir dessa avaliação foi realizada a validação experimental do modelo matemático obtido por meio de ensaios em triplicata com o meio otimizado pelo planejamento experimental, onde as condições críticas da concentração de etanol foram de 50 % (v/v) e a proporção soluto: solvente foi de 1:102 m/v a 37°C por 1 h em banho de ultrassom assistida. A média dos valores reais dos CFT da validação experimental foi de 18,08 ± 2,37, muito próxima ao valor predito pelo modelo matemático nas condições otimizadas que foi de 19,31 ± 3,64 µg de EAG/mg de farinha de casca de cupuaçu, confirmando que o modelo obtido foi capaz de prever satisfatoriamente o conteúdo de CFT extraídos.

Concentrações de etanol são determinantes para a extração dos compostos fenólicos devido à polaridade dos solventes, alterando-a, se promove uma maior extração dos compostos fenólicos presentes na matriz das plantas^[20]. Concentrações inferiores a 25% são relatadas em outros trabalhos de frutas tropicais^{[21, 22]} , enquanto neste os valores variaram entre 6,90 e 16,20 µg GAE/mg a depender da razão entre soluto e solvente. Outros trabalhos relatam altas concentrações do solvente para as extrações do cupuaçu^{[23, 24]} , e neste trabalho as concentrações variaram de 6,76 a 16,57 µg GAE/mg, indicando que para a extração de compostos fenólicos da casca da fruta de cupuaçu, o aumento da apolaridade representa um leve aumento, de 0,37 µg GAE/mg, do teor desses compostos no extrato. Extrações utilizando o etanol 50% são frequentes no preparo de extratos vegetais com o interesse em prospectar compostos fenólicos^{[25, 26]} , no presente trabalho, essa porcentagem de etanol levou uma variação de CFT de 6,26 a 19,00 µg GAE/mg, sendo a proporção que se encontrou a melhor extração dos CFT da casca do cupuaçu. Nesse processo, essa matriz vegetal apresenta um perfil polar mais favorável para se obter uma extração otimizada dos compostos fenólicos.

No quesito razão entre soluto e solvente, valores com menores proporções apresentaram os maiores teores desses compostos bioativos, indicando que a maior quantidade de solvente favorece a solubilização evitando que haja uma saturação do meio^[27]. O crescimento dessa bioatividade ao decorrer do aumento da razão, também é relatado por outros trabalhos analisando outras frutas^{[20, 28]}.

O delineamento experimental utilizado neste trabalho para calcular a proporção e razão para a extração de compostos fenólicos, não apenas mostrou ser eficiente, como em comparação com os resultados de outro trabalho para a casca do cupuaçu^[25] que usou a razão 1:8 (soluto: solvente) com dois diferentes solventes, o metanol-acidificado (50%) e a acetona (70%), o valor otimizado nesta pesquisa mostrou-se 87% mais eficiente do que o encontrado em literatura. Já outro trabalho^[21] , utilizando a casca e sementes, com a proporção de 1:10 (soluto: solvente) em etanol 12% demonstrou ser significativamente mais eficiente para essa matéria-prima. Um estudo^[22] utilizando a razão 1:5 (soluto: solvente) e etanol 20% relatam um teor de 7,4 µg GAE/mg, demonstrando menos eficiente, o que reforça o fato de que uma alta razão desfavorece a solubilização desses compostos, como previamente relatado.

O resíduo demonstrou ser uma fonte rica de compostos com grande importância biológica como os flavonoides e taninos, além de uma alta atividade antioxidante (TABELA 4). Em relação aos flavonoides, os valores expressos são maiores para o resíduo do que relatado por trabalhos com a polpa ou licores do cupuaçu^{[22, 25]} , bem como sua atividade antioxidante^{[23- 30]}. Quando comparado a outros trabalhos com frutas tropicais, os valores de CFT e potencial antioxidante são próximos, como é o caso do caju, caimito, goiaba, mamão papaia, e outros^{[26, 31]}.

Comparando os valores otimizados de extração com trabalhos que envolvem a quantificação de compostos bioativos na polpa do cupuaçu^{[32, 33]} é possível observar que uma parte considerável da atividade antioxidante desse fruto está na casca, justificando seu uso comercial nas indústrias de alimentos, cosméticos, chocolate e bebidas^[9]. Além disso, foi possível também verificar uma correlação direta entre compostos fenólicos e atividade antioxidante presente no resíduo.

Conclusão

Foi possível extrair os compostos fenólicos da casca de cupuaçu por ultrassom assistida, utilizando o método DCCR, o qual foi eficiente na avaliação e na otimização da extração dos compostos fenólicos, sendo influenciado tanto pela concentração de etanol, como pela proporção de amostra e solvente na extração.

Fontes de Financiamento

Nenhuma.

Conflito de Interesses

Não há conflito de interesses.

Agradecimentos

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e à Universidade Federal do Oeste do Pará (UFOPA).

Colaboradores

Concepção do estudo: HAS; LESB; DKTM
Curadoria dos dados: HAS; DKTM
Coleta de dados: HAS; ASS; AFSV; KSO
Análise dos dados: BAS; DKTM
Redação do manuscrito original: HAS
Redação da revisão e edição: DKTM; BAC; LESB.

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