Estudo Farmacognostico de Flores de Tagetes patula L. (AsteraCeae)

Resumo

O estudo foi conduzido para o desenvolvimento de parâmetros farmacognósticos de flores de Tagetes patula L. As avaliações foram realizadas de acordo com a Farmacopeia Brasileira e/ou literatura especializada. Testes colorimétricos detectaram a presença de flavonoides, taninos e fenólicos simples. Por meio de técnicas cromatográficas: cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi possível desenvolver um perfil cromatográfico adequado e estabelecera presença das substâncias quercetina e rutina. Os resultados para a perda por dessecação, teor de cinzas totais, teor de extrativos, teor de resíduo seco e teor em flavonoides totais foram de: 9,35%, 5,50%, 39,54%, 46,61% e 5,24% respectivamente. No ensaio por hidro-destilação, o rendimento do óleo essencial nas flores foi de 0,15%. Estes dados fornecem informações importantes para a correta identificação e padronização de flores de T patula.

Palavras chave:

Tagetes patula.

Avaliação farmacognóstica.

Triagem fitoquímica.

Perfil cromatográfico.

Flavonoides.

Abstract

The current study was conducted to develop the pharmacognostic standards for Tagetes patula flowers. These evaluations were performed according to the Brazilian Pharmacopoeia and/or literature specialized. Colorimetric tests detected the presence flavonoids, tannins and simple phenolics. By thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC) it was possible to develop a fingerprint suitable and correlating the presence of chemical substances, quercetin and rutin. The results for loss on drying, total ash content, extractives content, total solids content and total flavonoid content were: 9.35%, 5.50%, 39.54%, 46.61%, and 5.81%, respectively. The yield of essential oil in flowers was 0.15%. This study provides important information for correct identification and standardization offlowers of T. patula.

Keywords:

Tagetes patula.

Pharmacognostic evaluation.

Phytochemical screening.

Chromatographic proflie.

Flavonoids.

Introdução

Tagetes patula L. (Asteraceae), popularmente conhecida como cravo-francês, cravo-de-defunto ou botões-de-solteirão, tem origem no México. Foi introduzida no Brasil há muitos anos, onde se aclimatou perfeitamente, tornando-se subespontânea. A espécie é muito utilizada como ornamental em jardins e floreiras, sendo comercializada livremente em feiras populares e floriculturas (Vasudevan, Kashyap e Sharma, 1997). Na medicina popular suas flores e folhas têm sido utilizadas como antisséptica, diurética, depurativa e repelente de insetos (Chadha, 1976).

A investigação de sua composição química aponta até o presente, flores e folhas ricas em terpenos (Dharmagadda et al., 2005; Restello, Menegatt e Mossi, 2009) flavonoides (Piccaglia, Marotti e Grandi, 1998; Faizi et al., 2011a ), alcaloides (Faizi e Naz, 2002), carotenoides (De Las Rivas, 1989), tiofenos (Rajasekaran, Ravishankar e Reddy, 2004) e ácidos graxos (Deineka et al., 2007), substâncias estas que provavelmente estejam envolvidas com as atividades biológicas relatadas até o momento, entre elas: atividade inseticida (Wells, Bertsch e Perich, 1993), nematicida (Buena et al., 2008), larvicida (Rajasekaran, Ravishankar e Reddy, 2004; Dharmagadda et al., 2005; Faizi et al., 2011b ), hepatoprotetora (Vasilenko et al., 1990), anti-hipertensiva (Saleem et al., 2004), analgésica (Faizi et al., 2011a), anti-inflamatória (Kasahara et al., 2002), antibacteriana (Rondón et al., 2006), antiviral (Ananil et al., 2000), antifúngica (Mares et al., 2004; Romagnoli et al., 2005; Faizi et al., 2008) e como corante para alimentos (Vasudevan, Kashyap e Sharma, 1997).

No entanto, apesar da ampla literatura sobre as propriedades biológicas e constituição química da espécie, não existem relatos publicados sobre os parâmetros farmacognósticos para a avaliação da droga vegetal T. patula. Assim, diante do potencial da espécie para o desenvolvimento de fitoterápicos e/ou insumos naturais inseticidas e nematicidas, é premente o estabelecimento de parâmetros de qualidade para a espécie. Visando dar uma contribuição ao estudo farmacognóstico da espécie T patula, este trabalho tem o intuito de pesquisar a presença de constituintes do metabolismo secundário, determinar o teor de óleo essencial, perda por dessecação, teor de cinzas totais, teor de extrativos, teor de resíduo seco, teor em flavonoides, e estabelecer um perfil cromatográfico a partir de flores cultivadas.

Materiais e métodos

Material vegetal: Sementes de T patula foram fornecidas por doação por Syngenta Flowers Brazil e cultivadas organicamente no Horto de Plantas Medicinais da Universidade Estadual de Londrina, Londrina, PR. As flores de T patula foram coletadas em novembro de 2011 e o material foi identificado pelo Prof. Dr. Jimi Naoki Nakagima, da Universidade Federal de Uberlândia. Material testemunho encontra-se depositado como documento taxonômico no Herbário da Universidade Estadual de Maringá sob o número HUM 21.907.

As flores foram secas em estufa de circulação forçada de ar (Pardal), aquecida a 38±2 °C e cominuídas em moinho de martelo (Tigre ASN5).

Preparação do extrato: Para a obtenção do extrato, a droga vegetal foi utilizada sem separação granulométrica. O material vegetal foi inicialmente desengordurado com n-hexano por maceração dinâmica durante seis dias. Após secagem, as flores desengorduradas Acaram em maceração por 10 min e em seguida foram submetidas à extração utilizando dispersor Ultra-Turrax® (Ika, T-25) a 8000 rpm, na proporção de 2,5% (m/v), utilizando como líquido extrator uma mistura etanofágua (1:1 v/v), por um período de 9 min, com intervalos de 10 min, para que a temperatura não excedesse 40 °C. Após, o extrato foi filtrado, evaporado sob pressão reduzida e liofilizado (EB).

Solventes e reagentes: Todos os solventes e reagentes utilizados apresentavam grau analítico. Quercetina (Acros Organics) e Rutina (Fluka) foram usados como substâncias químicas de referência. Soluções estoques dos padrões foram preparadas na concentração de 100 μg/mL em metanol.

Avaliação fisíco-química: As análises para a determinação de perda por dessecação e determinação do teor de cinzas totais, foram realizadas de acordo com a Farmacopeia Brasileira (2010). A determinação do teor de extrativos, empregando-se a água como solvente, está de acordo com a técnica descrita em Deutsches (1986). Para a avaliação do teor de resíduo seco, foi produzido um extrato a 2,5% (m/v) em dispersor Ultra-Turrax® (Ika, T-25) a 8000 rpm, com 9,0 min de agitação e temperatura inferior a 40 °C, utilizando como líquido extrator uma mistura de água, etanol e metanol na proporção de 1:1:1 (v/v). Todos os ensaios foram conduzidos em triplicata.

Análise fitoquímica preliminar: A droga vegetal foi submetida à análise fitoquímica preliminar para detecção das principais classes de metabólitos secundários através de reações químicas que resultam no desenvolvimento de coloração e/ou precipitação, característico para cada classe de substâncias estudadas (Harborne, 1998; Schenkel, Gosmann e Athayde, 2011).

Análise cromatográfica: Para o ensaio por cromatografia em camada delgada (CCD), foram utilizadas placas de alumínio de gel de sílica F254 (Merck®), (100 x 50 mm). O cromatograma foi desenvolvido em câmara saturada, empregando como fase móvel uma mistura de tolueno, acetato de etila, metanol e ácido fórmico (55:35:15:6; v/v), tendo como substâncias de referência, quercetina e rutina. O EB foi retomado em metanol na concentração de 1,45 mg/mL. Alíquotas do extrato (20 μL) e das soluções padrões (10 μL) foram adicionadas sobre a placa com o auxílio de micropipe- tas volumétricas, na forma de bandas. A placa foi de senvolvida a uma distância de 80 mm, à temperatura ambiente. Após o desenvolvimento, foi seca em estufa à temperatura de 105 ⁰C, e em seguida pulverizada com difenilborato de aminoetanol a 1% (p/v) em me tanol, seguido de uma solução de macrogol 400 a 5% (p/v) em metanol. Após, foi examinada sob luz ultra violeta (254 e 365 nm) para visualização das bandas.

Para a cromatografia líquida de alta eficiência, o EB foi retomado em metanol na concentração de 725 μg/mL. Foi empregado cromatógrafo líquidoThermo® equipado com PDA (photo diode array), detector espectrofotométrico (modelo Finnigan Surveyor PDA Plus Detector), bombas e degasser integrado (Finnigan Surveyor LC Pump Plus), autosampler (Finnigan Surveyor Autosampler Plus), equipado com um loop de 10 μL e controlador de software Chromquest. A temperatura do forno para coluna foi mantida em 25 °C e os cromatogramas foram observados a 210, 254 e 370 nm. Para o desenvolvimento dos cromatogra mas, foram usados pré-coluna (4 x 3 mm d.i.) e coluna (250 x 4,6 mm d.i.) C-18 Phenomenex®, modelo Gemini, porosidade 5 μm. A separação cromatográfica foi realizada utilizando água (fase A) e acetonitrila (fase B) em sistema gradiente, com vazão de 1,0 mL/min. O programa estabelecido foi: 0 min: 5% fase B; 35 min: 58% fase B. Após, 5 min para reequilíbrio da coluna com 5% da fase B.

Determinação de flavonoides totais: Medições espectrofotométricas foram realizadas em espectrofotômetro Shimadzu UV-Vis, modelo PC-1650, com cubetas de quartzo QS. A determinação do teor de flavonoides totais na droga vegetal foi realizada seguindo o método proposto na monografia da calêndula, de acordo com a Farmacopeia Brasileira, (2010), com algumas modificações. O ensaio foi realizado em triplicata.

Determinação do teor de óleos essenciais: A determinação do teor de óleos essenciais foi conduzida de acordo com o método geral proposto para a determinação de óleos voláteis em drogas vegetais (Farmacopeia Brasileira, 2010). A avaliação foi realizada em triplicata.

Análise estatística: A avaliação estatística dos resultados foi realizada através do Software STATISTICA® e Excel®.

Resultados e Discussão

Os resultados da avaliação físico-química estão descritos na Tabela 1.

A perda por dessecação, ensaio importante para a qualidade de drogas vegetais, refere-se ao teor de umidade e/ou substâncias voláteis presentes na espécie. O excesso de umidade em matérias-primas vegetais permite a ação de enzimas, com a possibilidade da degradação de constituintes químicos e desenvolvimento de fungos e bactérias (Farias, 2011). De acordo com Simões et al. (2011), o teor máximo de umidade estabelecido para drogas vegetais em diferentes farmacopeias varia entre 8 e 14%, com poucas exceções especificadas em monografias. O valor obtido no ensaio para T patula foi inferior a 14%, indicando que as operações preliminares empregadas no processamento pós-coleta (secagem e armazenamento), foram efetivas quanto à normalização do teor de umidade na droga vegetal. Em estudo realizado por Gazim et al. (2007), com as flores de calêndula, os resultados encontrados foram 11,6% de umidade residual nas flores secas, valor indicado como adequado, pois segundo os autores, o teor de umidade permitido em flores secas deve permanecer entre 8 a 15%. Assim, pode-se afirmar que valores característicos de perda por dessecação, além de informação importante do ponto de vista tecnológico, servem também como parâmetro de qualidade para as flores de T patula.

A determinação do teor de cinzas totais de um vegetal constitui um ensaio de pureza para verificar impurezas inorgânicas não-voláteis, que podem estar presentes como contaminantes (Farmacopeia Brasileira, 2010). O teor de cinzas totais estabelece a quantidade de substâncias residuais não voláteis, obtidas por incineração, representando a soma de material inorgânico integrante da espécie (cinzas intrínsecas) com as substâncias aderentes de origem terrosa (cinzas extrínsecas) (Simões et al., 2011). Isso significa que essa determinação é uma referência de qualidade e caracterização de um vegetal. Assim, a finalidade desse ensaio foi estabelecer o parâmetro de cinzas totais para T. patula, visto que o mesmo ainda não foi descrito na literatura. Na análise de cinzas totais o resultado foi 5,50%±0,2 (3,61%). Como não existem teores máximos para cinzas totais estabelecidos oficialmente para a espécie em estudo, este dado pode nortearfuturas averiguações de cinzas totais na espécie.

A determinação do teor de extrativos (TE) é um ensaio utilizado para estimar o potencial de substâncias extraíveis da droga vegetal em água, como aminoácidos, açúcares, heterosídeos flavonoídicos e mucilagens. Esta característica individual pode ser considerada como um parâmetro importante na avaliação da qualidade da droga vegetal, pois está relacionada às características sazonais, ou seja, a produção de determinados grupos de metabólitos secundários, durante as estações do ano. As flores de T patula apresentaram um teor de extrativos de 39,54%±0,52 (1,32%), que poderá ser utilizado como parâmetro para a avaliação de novos lotes de matéria-prima vegetal. Outro parâmetro avaliado, e considerado como uma característica individual para a droga vegetal é a determinação do teor de resíduo seco (RS), utilizando como líquido extrator uma mistura de água, etanol e metanol em proporção volumétrica. Neste ensaio o resultado foi de 46,61%±0,49 (1,05%).

A triagem fitoquímica foi conduzida para caracterizar a composição química das flores de T patula. Os resultados obtidos na avaliação fitoquímica preliminar corroboraram dados de literatura sobre a presença de compostos fenólicos na espécie, entre eles flavonoides, fenólicos simples e taninos. Foi observada uma maior intensidade nas reações para flavonoides. Essa intensidade pode ser devido à função desses constituintes em proteger os vegetais contra a incidência de raios ultravioleta e visível, além de proteger contra insetos, fungos, vírus e bactérias. As reações para os taninos foram menos acentuadas do que para os fenólicos simples.

Todas as identificações na CCD foram baseadas na comparação das distâncias de migração (valores de Rf) e da cor das bandas entre a amostra e os padrões utilizados, antes e após a pulverização da placa com o agente cromogênico específico (Figura 1).

A CCD é uma ferramenta que permite analisar a composição e a pureza do material estudado, auxiliando na identificação de problemas como a adulteração ou falsificação da espécie vegetal de interesse. É um método descrito em monografias de droga vegetais de vários códigos oficiais como ensaio de identificação e autenticidade. De acordo com o perfil cromatográfico obtido e correspondência com os valores de Rf dos padrões verifica-se que EB apresenta manchas correspondentes à quercetina (Rf= 0,58) e rutina (Rf= 0,10) com maiores intensidades, bem como uma terceira banda muito intensa com valor de Rf de 0,18. Assim, a metodologia desenvolvida na obtenção de um perfil cromatográfico por CCD para o EB de flores de T patula mostrou-se adequada para o reconhecimento da espécie, e pode ser utilizado como "impressão digital" para a droga vegetal, nas condições avaliadas.

Através do desenvolvimento de um sistema gradiente para a separação dos constituintes químicos do EB por CLAE (Figura 2), foi possível obter uma boa separação dos picos de interesse em 35 min. Por esse sistema foi possível determinar o tempo de retenção da quercetina (15,96 min) através dos dados espectroscópicos do padrão.

Os resultados obtidos com as análises cromatográficas (CCD e CLAE) mostraram que os métodos desenvolvidos são ferramentas simples e sensíveis, e que podem ser prontamente utilizadas como adequados para assegurar a autenticidade de flores de T patula. A presença de flavonoides em T patula foi confirmada pela expressiva intensidade na reação de Shinoda, e corroborada pelos dados de literatura sobre o isolamento desta classe de metabólitos secundários na espécie (Piccaglia, Marotti e Grandi, 1998; Faizi et al., 2011a ). Assim, optou-se pela determinação do teor de flavonoides na droga vegetal. O resultado do ensaio para a determinação de flavonoides totais foi de 5,24%±0,08 (1,53%), média muito superior ao encontrado para drogas vegetais ricas em flavonoides descritas na literatura (Santos e Blatt, 1998; Petrovick e Mello, 2000; Borella e Fontoura, 2002). Provavelmente, este dado esteja relacionado com a época de colheita (sazonalidade) e com a intensidade de insolação, visto que a espécie foi cultivada em canteiros ensolarados.

O rendimento de óleo essencial em massa seca foi de 0,15%±0,007 (4,66%). Resultado muito semelhante aos 0,14 % (m/m) descrito por Szarka e colaboradores (2006), que avaliaram a presença de monoterpenos, sesquiterpenos e tiofenos em flores de T patula.

No Brasil, um dos grandes desafios na utilização das plantas medicinais é a baixa qualidade das matérias-primas vegetais. Os problemas mais frequentes são as adulterações, a não uniformidade da composição química e as contaminações, que podem ocorrer em qualquer uma das etapas na cadeia produtiva (Farias et al., 1985). Portanto, o estabelecimento de parâmetros de qualidade para as drogas vegetais de uso medicinal é fundamental para a consolidação da Fitoterapia, como prática médica segura e eficaz.

Assim, os resultados obtidos neste estudo desempenham um papel significativo na definição de parâmetros farmacognósticos para a caracterização e identificação de flores de T patula, e contribuem para a obtenção de padrões de qualidade para a espécie vegetal.

Agradecimentos

Os autores agradecem o apoio financeiro da Fundação Araucária, Agro Aliança Comercial Atibaia Ltda., distribuidor exclusivo da Syngenta Flowers Brazil pela doação das sementes e a Admir Arantes e Claudio Roberto Novello pela colaboração e auxílio técnico.

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