Polifenóis totais de Aloysia gratissima e biodisponibilidade depois de um tratamento oral subcrônico em ratos Wistar

Resumo

O presente trabalho realizou a quantificação de polifenóis totais no extrato aquoso das folhas de Aloysia gratissima, e o seu índice de absorção oral em ratos Wistar. Para tal, 20 ratos adultos foram divididos em cinco grupos de tratamento: solução salina; 100 mg/Kg do extrato de A. gratissima; 50 mg/Kg e 100 mg/Kg de rutina e co-tratamento com 50 mg/Kg de extrato e 10mg/Kg de rutina, realizados por via oral por 14 dias. Para a quantificação de polifenóis totais foi utilizado o método de Folin Ciocalteau. No extrato, a concentração de polifenóis totais foi 7,11 mg GAE/mL, no plasma dos animais controles o nível basal foi de 4,3 mg GAE/mL. Nos grupos tratados observou-se valores, significativamente, superiores de 9,32mg GAE/mL, 6,65 mg GAE/mL, 8,34 mg GAE/mL e 10,14 mg GAE/mL, respectivamente. Tais dados configuram a A. gratissima como uma boa fonte para obtenção de polifenóis totais, devido, tanto a sua alta concentração no extrato como também pela sua boa biodisponibilidade.

Palavras-chave:

Disponibilidade biológica.

Absorção.

Terapêutica.

Abstract

The present work carried out the quantification of total polyphenols in the aqueous extract of the leaves of Aloysia gratissima, and its oral absorption index in Wistar rats. For this, 20 adult rats were divided into five treatment groups: saline solution; 100 mg/Kg of A. gratissima extract; 50 mg/Kg and 100 mg/Kg of rutin and co-treatment with 50 mg/Kg of extract and 10 mg/Kg of rutin, performed orally for 14 days. For the quantification of total polyphenols, the Folin Ciocalteau method was used. In the extract, the concentration of total polyphenols was 7.11 mg GAE/mL, in the plasma of control animals the baseline level was 4.3 mg GAE/mL. In the treated groups, significantly higher values were observed, of 9.32 mg GAE/mL, 6.65 mg GAE/mL, 8.34 mg GAE/mL and 10.14 mg GAE/mL, respectively. Such data configure A. gratissima as a good source for obtaining total polyphenols due both to its high concentration in the extract and also to their good bioavailability.

Keywords:

Biological availability.

Absorption.

Therapy.

Introdução

Polifenóis, ou compostos fenólicos, são moléculas que contêm anéis aromáticos ligados a uma ou mais hidroxilas, possuem importante papel antioxidante e anti-inflamatório e podem ser grandes aliados na manutenção da saúde^[1]. No entanto, a biodisponibilidade dos polifenóis, ou seja, a quantidade de compostos que o organismo consegue absorver e utilizar, é uma preocupação relevante. Uma vez que ela depende de fatores físico-químicos do composto alvo, assim como da sua bioacessibilidade, ou seja, o quanto ele é extraído e solubilizado no alimento. Nem todos os compostos de interesse farmacológico e/ou funcional presentes nas plantas realmente chegam aos seus alvos terapêuticos, como é o caso dos polifenóis, cuja absorção no trato gastrointestinal é baixa^[2].

A Aloysia gratissima (Gilles & Hook) Tronc. possui potencial antioxidante e anti-inflamatório bem conhecidos, seu composto majoritário é o flavonoide rutina, também com capacidades medicinais já descritas^[1]. Diante do exposto, este estudo teve como objetivo quantificar os polifenóis presentes na planta A. gratissima e avaliar sua absorção gastrointestinal, assim como do seu flavonoide majoritário, a rutina.

Material e Métodos

Preparo do extrato

As amostras de Aloysia gratissima foram coletadas em fevereiro de 2021, na cidade de Uruguaiana-RS, Brasil. Uma exsicata se encontra no herbário Bruno Edgar Irgang sob o número de registro HBEI 1639.

Depois de coletadas, o extrato foi obtido das folhas, secas à temperatura ambiente e abrigadas do sol, maceradas, utilizando água destilada como extrator, em uma proporção de 50 g para lL. Para a realização da extração a mistura foi acondicionada em frascos âmbar, sob refrigeração, à 5ºC, por sete dias. Ao fim o material foi filtrado, utilizando um filtro de papel e algodão, o extrato resultante foi liofilizado e armazenado à -20ºC.

Modelo experimental

O protocolo foi previamente submetido ao Comitê de Ética no Uso de Animais da instituição, sendo aprovado sob o número de registro 021/2021. Foram utilizados 20 ratos Wistar machos adultos, pesando aproximadamente 350 g, adquiridos, e mantidos, no biotério da UNIPAMPA, o Biopampa, permanecendo em ambiente controlado, com ciclo claro/escuro de 12 h, temperatura de 22±2ºC, água e alimentação à vontade.

Para o desenho experimental, os 20 animais foram divididos em cinco grupos de tratamentos: 100 mg/Kg do extrato de Aloysia gratissima (AG), 50 mg/kg (R50) e 100 mg/kg (R100) de rutina, e o cotratamento de ambos, com com 50 mg/kg de extrato e 10 mg/kg de rutina (AG+R), administrados por gavagem, diariamente, por 14 dias. Ao fim deste tempo os animais foram anestesiados e eutanasiados por punção cardíaca. O sangue coletado foi centrifugado e armazenado -20ºC para testes posteriores.

Quantificação de polifenóis totais no extrato e nas amostras biológicas

Utilizou-se o método de Folin Ciocalteu, no qual 500 mg do extrato foi ressuspendido em 1 mL de água destilada, seguido por diluição na proporção de 1:1000, afim de obter-se uma amostra de absorbância confiável. À uma das alíquotas adicionou-se o reagente Folin Ciocalteau e Na₂CO₃ 20%. Fez-se a leitura da absorbância utilizando um espectrofotômetro (SP-22 monofeixe da Biospectro), à 730 nm. Calculou-se a concentração de polifenóis foi calculada a partir equação da reta obtida pela curva padrão confeccionada utilizando cinco diferentes diluições de ácido gálico, 0,025, 0,020, 0,015, 0,010 e 0,005 mg/mL, feitas em triplicata, sendo o resultado expresso em mg GAE/mL^[3].

As amostras de soro passaram pelo mesmo processo geral, sendo diluídas em PBS de pH 7,4, diluídas 1:100 e centrifugadas a 1500 rpm por 10 min antes da leitura.

Análise estatística

Realizou-se uma ANOVA one way com 95% de significância, seguida de teste de comparações múltiplas de Tukey, empregando o software GraphPad prism 9, os resultados foram expressos em média ± DP.

Resultados e Discussão

Para quantificar a concentração de polifenóis totais da amostra, construiu-se a curva de absorção de um composto conhecido, neste caso foi utilizado o Ácido Gálico, a equação da reta obtida foi y=64,473x-0,0642, com de R²=0,9912. A partir desta, calculou-se a concentração de polifenóis no extrato aquoso, obtendo 7,11 mg GAE/mL de polifenóis totais, o que condiz com 1,42% do extrato total. Não foram encontrados na literatura dados referentes aos valores de polifenóis totais de A. gratissima, porém, em estudo anterior de Faller e Fialho^[4], no qual foi quantificado, utilizando a mesma metodologia, os polifenóis totais dos 12 alimentos mais consumidos pelos brasileiros, encontrou-se o maior valor para a banana, com 215,7 mg EAG/ 100 g de peso fresco. Esse valor, convertido para a diluição aqui utilizada, daria um total de 1,07 mg GAE, cerca de 6x menos do que o extrato aqui utilizado. Sabendo que diferentes formas de processamento, principalmente que envolvam temperatura e exposição à luz, podem afetar negativamente essa produção de polifenóis^[2], acredita-se que a matéria vegetal verde, como geralmente é consumida a planta estudada, pode ter valores ainda mais expressivos dos aqui encontrados.

Porém, sabe-se que a capacidade de absorção dos polifenóis pelo organismo é apenas uma parte, por vezes muito pequena, da quantidade total de polifenóis consumida. Na FIGURA 1 pode-se observar que, de maneira geral, todos os tratamentos empregados aumentaram significativamente o valor de polifenóis (p<0,0001) no soro dos animais tratados.

Nos animais do grupo AG, foram encontrados valores de 9,32 mg GAE/mL, o que, descontando o valor de 4,3 mg GAE/mL encontrado para o controle, pode-se dizer que a diferença de 5,02 mg GAE/mL de polifenóis foram advindos do tratamento. Lembrando que, 500 mg do extrato tem uma concentração de 7,11 mg GAE/mL, e que a dose administrada aos animais foi de 100 mg/kg, por 14 dias, totalizando, aproximadamente, 6,97 mg GAE/mL de polifenóis administrados. Sendo assim, pode-se dizer que os animais absorveram 72% dos polifenóis administrados durante o tratamento, mostrando um bom potencial de absorção. Tal resultado é interessante uma vez que, geralmente, a biodisponibilidade de compostos administrados retorna a níveis séricos 4 h depois da administração^[5], tempo que se excedeu no presente estudo.

No grupo R50 encontrou-se 6,65 mg GAE/mL, o que, diminuindo-se do valor basal, demonstra uma absorção de 2,35 mg GAE/mL dos 245 mg do flavonoide administrado (0,95%), mostrando que a rutina não é tão bem absorvida, ou rapidamente metabolizada, pelo organismo, o que é confirmado quando se dobra a dose no grupo R100, e a absorção foi de 4,04 (0,82%). Já o grupo AG+R teve uma absorção de 5,84 mg GAE/mL, dos 52,48 mg GAE/mL administrados durante o tratamento (11,12%), sendo que 3,48 mg GAE/mL de polifenóis foram disponibilizados pelo extrato.

Conclusão

Tais dados configuram a A. gratissima como uma boa fonte para obtenção de polifenóis totais. Tanto devido à sua alta concentração no extrato, como também pela sua boa disponibilidade e conservação, superando, inclusive, a biodisponibilidade advinda da administração isolada do flavonoide rutina.

Fontes de Financiamento

Bolsas da CAPES, UNIPAMPA, CNPq e FAPERGS.

Conflito de Interesses

Os autores não apresentam conflito de interesses.

Agradecimentos

À CAPES, UNIPAMPA, CNPq e FAPERGS pela concessão de bolsas.

Colaboradores

Concepção do estudo: GES; VM; ND.
Curadoria dos dados: GES; ND; EGS; LSS.
Coleta de dados: GES; GEB; CBP; LTM.
Análise dos dados: GES; SMMSS; RTM.
Redação do manuscrito original: GES; VM; ND.
Redação da revisão e edição: GES; VM; ND.

Referências

1. Schreiner GE. Efeito da suplementação com o extrato aquoso de Aloysia gratissima (Gillies & Hook.) Tronc. e rutina em ratos machos e fêmeas com comportamento tipo depressivo: avaliação de parâmetros bioquímicos, oxidativos e inflamatórios. Uruguaiana; 2022. 107 p. Dissertação de Mestrado. [Programa de Pós-Graduação em Bioquímica] - Universidade Federal do Pampa, Uruguaiana, RS, 2022. [https://dspace.unipampa.edu.br/handle/riu/7657].

2. Arnoso BJM, Costa GF, Schmidt B. Biodisponibilidade e classificação de compostos fenólicos. Nutr Brasil. 2019; 18(1): 39. [https://doi.org/10.33233/nb.v18i1.1432].

3. Sigleton VL, Orthofer R, Lamula-Raventós RM. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent. Meth Enzymol. 1999; 299: 152-178. [https://doi.org/10.1016/S0076-6879(99)99017-1].

4. Faller ALK, Fialho E. Disponibilidade de polifenóis em frutas e hortaliças consumidas no Brasil. Rev Saúde Públ. 2003; 43: 211–218. [https://doi.org/10.1590/S0034-89102009005000010].

5. Goldberg DM, Yan J, Soleas GJ. Absorption of three wine-related polyphenols in three different matrices by healthy subjects. Clin Biochem. 2003; 36(1): 79–87. [https://doi.org/10.1016/s0009-9120(02)00397-1].