Triagem in silico de compostos com atividade ansiolítica encontrados na espécie Magnolia obovata

Resumo

A Magnolia obovata,conhecida como "pepino japonês", é uma árvore caducifólia de origem asiática, constituindo-se uma planta medicinal pelos seus efeitos anti-inflamatório, ansiolítico, antidepressivo, entre outros efeitos centrais, já demonstrados em literatura. O objetivo deste estudo foi sugerir os mecanismos de atuação para efeitos no sistema nervoso central dos compostos identificados na espécie M. obovata, sobretudo quanto ao efeito ansiolítico atualmente buscado com o uso da planta. Foram identificados 19 compostos presentes na M. obovata, sendo que apenas 2 moléculas (alfa-eudesmol e gama-eudesmol) apresentaram propriedades farmacocinéticas e toxicológicas in silico favoráveis à bioatividade ansiolítica. Tais moléculas inibem a hidrolase de acilcarnitina e aumentam a acilcarnitina livre, possivelmente gerando o efeito ansiolítico. A modelagens farmacofóricas dessas moléculas apresentaram 6 pontos de interação com os cinco ligantes mais potentes conhecidos da hidrolase de acilcarnitina e tal semelhança estrutural é promissora para atuação sobre esse alvo.  Há vantagens do mecanismo de ação alternativo desse composto em relação aos ansiolíticos atuais, que poderá ser utilizado para formulação de novas terapias no tratamento do transtorno de ansiedade. Os resultados aqui obtidos abrem perspectivas para futuros testes em modelos in vitro e in vivo, visando confirmar os resultados das análises computacionais.

Palavras-chave:

Plantas Medicinais.

Efeito Central.

Modelagem Farmacofórica.

In sílico.

Abstract

Magnolia obovata, known as "Japanese cucumber", is deciduous tree of Asian origin, constituting a medicinal plant due to its anti-inflammatory, anxiolytic, antidepressant effects, among other central effects, already demonstrated in the literature. The objective of this study was to suggest the mechanisms of action for the effects on the central nervous system of the compounds identified in the species M. obovata, especially regarding the anxiolytic effect currently sought with the use of the plant. Nineteen compounds present in M. obovata were identified, with only 2 molecules (alpha-eudesmol and gamma-eudesmol) showing in silico pharmacokinetic and toxicological properties favorable to anxiolytic bioactivity. Such molecules inhibit acylcarnitine hydrolase and increase free acylcarnitine, possibly generating an anxiolytic effect. Pharmacophoric modeling of those molecules showed 6 interaction points with the five most potent known ligands of acylcarnitine hydrolase and such structural similarity is promising for acting on this target. There are advantages of the alternative mechanism of action of this compound in relation to current anxiolytics, which could be used to formulate new therapies in the treatment of anxiety disorders. The results obtained here open perspectives for future tests in in vitro and in vivo models, aiming to confirm the results of the computational analyses.

Keywords:

Medicinal plants.

Central Effect.

Pharmacophoric Modeling.

In silico.

Introdução

As plantas medicinais são utilizadas, historicamente, para o manejo e prevenção de enfermidades, constituindo-se uma prática que remete aos primórdios das civilizações humanas. Trata-se de um recurso acessível e culturalmente construído, e que tem tido atenção da indústria farmacêutica e de estudos científicos, nas últimas décadas, pela possibilidade de extração de moléculas que possuam atividades biológicas em seres humanos^[1,2]. Entre essas plantas estão, por exemplo, Aloe vera (babosa), Matricaria chamomilla (camomila) e Cannabis sativa (cannabis). Nesse contexto, com o desenvolvimento das técnicas de química médica, tem-se o captopril (inibidor da ECA), como um exemplo de fármaco obtido a partir de uma planta. Desse modo, há de se considerar as plantas medicinais como importantes fontes de moléculas bioativas^[3].

Magnolia obovata, popularmente conhecida como "pepino japonês", é uma árvore caducifólia de origem asiática, constituindo-se uma planta medicinal de longa história de uso na China, Coréia e Japão, pelos seus efeitos anti-inflamatório, antioxidante, ansiolítico, antidepressivo, entre outros efeitos centrais^[4]. O efeito ansiolítico é o mais buscado com o uso da planta e o principal investigado em literatura científica. Estudos realizados em camundongos investigaram o efeito ansiolítico de extrações da M. obovata, por meio de análises de comportamento dos animais, e houve a demonstração de que a planta possivelmente reduz a neuroinflamação e atua no sistema GABAérgico^[4].

Há de se ressaltar que os transtornos de ansiedade são uma das condições psiquiátricas mais prevalentes no mundo, com manifestações clínicas capazes de gerar importantes prejuízos no funcionamento normal do indivíduo, uma vez que são de início precoce, tendem a persistir ao longo de toda a vida, o que culmina em importante incapacitação e aumento do custo social do indivíduo^[5]. Atualmente, o tratamento farmacológico dessa condição é feito, na maioria dos casos, com inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS) ou inibidores seletivos da recaptação de serotonina e de noradrenalina (ISRSN), que possuem efeitos colaterais como disfunção sexual, ganho de peso e alteração do sono, contribuindo para a descontinuação do tratamento^[6].

Diante do exposto, a M. obovata mostrou-se espécie com potencial para obtenção de compostos bioativos com atividade ansiolítica. A triagem dos compostos químicos encontrados nessa espécie, já descritos em literatura cientifica, permite realizar estudo in silico. Este, utilizando-se de métodos computacionais, gera menores impactos éticos e econômicos, associado à maior confiabilidade dos resultados obtidos^[7].

Tem-se como objetivo, portanto, descrever as propriedades químico-biológicas dos compostos identificados nas partes da M. obovata e selecionar aqueles com propriedades químicas e estruturais propensas à atividade biológica. Assim, espera-se elucidar os mecanismos de ação biológica dos compostos já descobertos, além de investigar outros ainda não descritos na literatura.

Materiais e Métodos

Triagem in sílico de bioatividade

O levantamento bibliográfico acerca da Magnolia obovata foi feito através do Science Direct, PubMed e Scielo. Utilizaram-se os descritores "Magnolia obovata", "Chemical compounds" e "anxiolytic" para obter publicações de 2007 a 2020. Assim, com a identificação das moléculas presentes na M. obovata, a triagem de bioatividade pôde ser feita a partir do "Swiss ADME"^[8], "Swiss Target Prediction"^[8], "PASS Prediction"^[9] e "ProTox II"^[10], os quais oferecem análises farmacocinéticas, farmacodinâmicas e toxicológicas, baseadas na estrutura molecular de cada componente químico. Para fins de efeito ansiolítico, todas as predições de atividade de ação central foram julgadas vantajosas. Dentre elas, a inibição da hidrolase de acilcarnitina tinha estreita relação com o efeito buscado e foi selecionada, portanto, para análise farmacofórica.  

Análise farmacofórica

A plataforma "Binding DB" foi utilizada para buscar moléculas que sabidamente atuam sobre a hidrolase de acilcarnitina. As moléculas de maior afinidade com esses receptores-alvo (IC50) foram selecionadas para obter os modelos farmacofóricos.

Utilizou-se o servidor PharmaGist, que gera modelos 3D a partir de tais moléculas conhecidas por atuarem no receptor selecionado. O algoritmo do PharmaGist consegue demonstrar os modelos farmacofóricos de maior pontuação ao realizar uma diversidade de encaixes molécula-receptor, estabelecendo o melhor posicionamento espacial para que a atividade promovida pelo receptor seja máxima^[11]. Desse modo, os cinco ligantes mais potentes (filtrados pelos menores valores de IC50), obtidos no Binding DB, foram comparados espacialmente com o alfa e o gama-eudesmol em relação à disposição de possíveis grupos farmacofóricos. A existência de semelhanças estruturais entre essas moléculas evidencia maior probabilidade de interação destas com o receptor-alvo para sugerir a atividade biológica buscada.

Resultados e Discussão

Com o levantamento bibliográfico, foram identificados 19 componentes distribuídos em todas as partes da planta, elucidados a partir de extrações com etanol e metanol, utilizadas buscando efeitos anti-inflamatório e antioxidante^[12]. A propriedade ansiolítica da espécie M. obovata já foi descrita em estudos in vivo realizados em camundongos^[13].

Todos os componentes foram submetidos à análise de predição farmacocinética pelo Swiss ADME^[8]. As moléculas selecionadas deveriam: inibir o mínimo de citocromos P450 hepáticos e ter capacidade de penetrar a barreira hematoencefálica (ao se pensar em atuação majoritariamente central). Ademais, a avaliação da biodisponibilidade oral permite classificar quais seriam as moléculas mais promissoras para se tornarem fármacos; tais parâmetros estão representados na TABELA 1. Para isso, considerou-se a classificação "druglike" pelos critérios de Lipinski ("regra dos cinco"). Esse critério estabelece que é mais provável uma molécula possuir bioatividade, quando administrada oralmente, se seguir regras: massa molar menor ou igual a 500 u.m.a.; número de receptores de ligações de hidrogênio menor ou igual a 10; número de doadores de ligações de hidrogênio menor ou igual a 50 e logP menor que 5^[14]. Portanto, os critérios de Lipinski apontam para o potencial do composto químico apresentar um perfil de biodisponibilidade satisfatório em seres humanos. Apenas 2 moléculas foram classificadas como druglike – alfa-eudesmol e gama-eudesmol.

Os 2 compostos químicos identificados anteriormente passaram por predição in silico de atividades biológicas, a partir dos servidores Swiss Target Prediction^[15] e PASS prediction^[9]. As predições baseiam-se na premissa de que moléculas estruturalmente semelhantes atuam em alvos e geram atividades em comum; assim, comparam-se componentes já conhecidos com os aqueles pesquisados a partir da M. obovata, predizendo receptores-alvo e ações.

Após o processo de análise farmacocinética, realizou-se a predição de toxicidade para os 2 compostos químicos selecionados. Essa predição, feita pelo servidor ProTox II^[10], consegue definir doses seguras de administração dos componentes pesquisados e classifica o nível de segurança em uma graduação de 1 a 6 (sendo classe 1 o menos seguro e mais tóxico, classe 6 o mais seguro e menos tóxico). Há a previsão de toxicidade aguda (administração oral), dos mecanismos de ação e dos alvos, determinando, por fim, os resultados do efeito tóxico, como citotoxicidade, hepatotoxicidade, carcinogênese, entre outros^[10]. Dessa forma, a classificação de toxicidade e, portanto, de segurança, das moléculas pesquisadas também funciona como filtro para análise de bioatividade – as moléculas comprovadamente mais seguras são preferidas.

A predição toxicológica baseia-se na estimativa da dose letal média (LD50), sendo o resultado de LD50 = 5000mg/Kg para o alfa-eudesmol e LD50 = 4300 mg/Kg para o gama-eudesmol. Ambas receberam classificação como seguras classe 5, o que corresponde a alto nível de segurança na análise in silico, de maneira que se justifica o uso dessas moléculas, devido à ampla janela terapêutica evidenciada (TABELA 1).

A plataforma PharmaGist^[11] busca identificar similaridades estruturais entre a estrutura 2D das moléculas pesquisadas e outras já conhecidas por atuarem no receptor-alvo de seres humanos; neste caso, a hidrolase de acilcarnitina. Avaliam-se características estruturais necessárias para que se tenha interação biologicamente ativa sobre o alvo buscado, a partir de análises bioinformáticas^[16]. Esse recurso contribui para o fortalecimento de simulações por meio de métodos computacionais e evita uso de animais em excesso no meio científico e, consequentemente, favorece a redução de conflitos éticos e de custos^[17]. Para a moléculas alfa e gama-eudesmol, encontrou-se um grupamento hidrogênio e cinco grupos hidrofóbicos semelhantes (FIGURA 1) às cinco moléculas que mais potentemente atuam sobre a hidrolase de acilcarnitina, obtidas no Binding DB. Os resultados farmacofóricos semelhantes para ambas as moléculas se devem ao fato de que são isômeras.

A carnitina é um éster obtido tanto a partir de carne na dieta e quanto sintetizado de forma endógena, sobretudo no fígado e nos rins. É responsável pela transferência de ácidos graxos do citosol para mitocôndria, para que ocorra a beta-oxidação e produção de energia, e transfere o grupo acetil formado para o citosol, formando a acilcarnitina^[18]. Está presente no sistema nervoso central e desempenha importante papel na acetilação de histonas e, assim, na modulação epigenética de expressão de genes associados à neuroplasticidade^[19]. Os baixos níveis de acilcarnitina estão associados a pacientes resistentes ao tratamento de transtornos depressivos^[20]. Em modelos in vivo, a suplementação da L-acilcarnitina mostrou-se associada à rápida melhora da disfunção glutamatérgica, que parece estar presente em pessoas com transtornos depressivos, pela redução do glutamato excessivo^[10]. De forma semelhante, foi descrito melhora autorrelatada de estados depressivos, em pacientes doentes renais crônicos que fazem hemodiálise, com essa suplementação^[21]. Ressalta-se, inclusive, a possibilidade de uso da dosagem de acilcarnitina como marcador para diferenciação de acompanhamento de pacientes com transtornos psiquiátricos; entre eles, o transtorno de ansiedade^[18].

O alfa-eudesmol e o gama-eudesmol, presentes na M. obovata e que foram considerados componentes promissores neste estudo, têm atuação inibitória sobre a hidrolase de acilcarnitina de acordo com as predições in silico. Essa enzima é responsável por degradação da acilcarnitina, separando o grupo acil da carnitina. Ou seja, acredita-se que tais moléculas geram, por fim, aumento da acilcarnitina livre, o que possivelmente contribui para o efeito ansiolítico descrito com o uso da planta^[22].

Atualmente, o tratamento farmacológico dos transtornos de ansiedade baseia-se em fármacos como: inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRSs), inibidores seletivos da recaptação de serotonina-noradrenalina (IRSNs), antidepressivos atípicos, benzodiazepínicos, antidepressivos tricíclicos, inibidores da monoamina oxidase, entre outros. Efeitos colaterais relacionados ao uso desses medicamentos incluem náusea, diarreia, constipação, tontura, vômitos, disfunções sexuais, fadiga, cefaleia, xerostomia, a depender da classe do fármaco^[23]. Apesar do grande arsenal terapêutico farmacológico para essa doença, o estudo a partir de plantas medicinais poderia fornecer subsídio para identificação de novos medicamentos com menos efeitos colaterais e eficácia comprovada para tratamento de transtornos de ansiedade.

Modelagem farmacofórica

Os encaixes do alfa-eudesmol e do gama-eudesmol com a hidrolase de acilcarnitina, feitos a partir da modelagem farmacofórica mostrou que as moléculas possuem as características necessárias para desencadear atividade desse receptor – isto é, possuem seis componentes estruturais (um grupamento hidrogênio e cinco grupos hidrofóbicos) semelhantes a outros cinco ligantes potentes desse mesmo alvo. Todavia, esses componentes compõem apenas a estrutura rígida do alfa e do gama-eudesmol, de maneira a apenas algumas partes alinhadas (FIGURA 1).

Considera-se que a modelagem farmacofórica foi adequada quando a semelhança de no mínimo três e no máximo seis características entre as moléculas que interagem com a hidrolase de acilcarnitina e as moléculas da M. obovata, neste caso, o alfa-eudesmol e o gama-eudesmol. Essas características podem ser receptoras ou doadoras de ligações de hidrogênio, grupos hidrofóbicos ou mesmo anéis aromáticos. De acordo com o servidor, estabelece-se pontuação de 3,0 para anéis aromáticos; 1,0 para cargas aniônicas/ catiônicas; 1,5 para doadores ou receptores de hidrogênio e 0,3 para grupos hidrofóbicos.Nas modelagens farmacofóricas do alfa e do gama-eudesmol com os cinco ligantes mais potentes da hidrolase de acilcarnitina, obtiveram-se seis pontos de interação, o que representa resultado promissor acerca da possibilidade de interação com o receptor-alvo estudado.

Destaca-se que os transtornos de ansiedade têm alta prevalência na população global, sendo que no ano de 2021, ainda em vigência da pandemia por COVID-19, foi identificado prevalência de ansiedade em 35,1% das pessoas em metanálise^[24]. Possuem sintomas de início precoce e persistentes ao longo da vida. São genericamente classificados em: transtornos do pânico, agorafobia sem pânico, transtorno de estresse pós-traumático, ansiedade de separação no adulto, transtorno de ansiedade generalizada, fobia social, transtorno obsessivo-compulsivo e fobia específica^[5]. Em sua fisiopatologia, os transtornos de ansiedade se caracterizam por uma relação complexa entre fatores psicológicos, comportamentais e ambientais. Pessoas acometidas por essa condição, parecem ter alterações como a dificuldade em tomar decisões e a ativação excessiva da região central responsável pela resposta à ameaça (circuito entre lobo pré-frontal, insula e amigdala)^[25].

Os medicamentos utilizados baseiam-se na modulação de neurotransmissores dessas regiões, atuando como inibidores seletivos de receptação de serotonina (ISRS) e inibidores seletivos da recaptação de serotonina e noradrenalina (IRSN), azapironas e benzodiazepínicos; os dois primeiros mais recomendados. Efeitos colaterais comumente relatados são náusea, constipação intestinal, sedação, cefaleia, insônia, disfunção sexual, entre outros^[25]. Com isto em vista, plantas medicinais contribuem com novas formas de tratamento que tenham menos efeitos colaterais.

Nesse contexto, evidenciou-se que o alfa-eudesmol e o gama-eudesmol atuam em uma via paralela e alternativa para obter o efeito ansiolítico, por meio da inibição da hidrolase de acilcarnitina obtida pelo estudo in sílico, potencialmente com menos efeitos colaterais, devido às suas baixas toxicidades (LD50 = 5000mg/Kg e LD50 = 4300 mg/Kg, respectivamente). O uso da Magnolia obovata para fins ansiolíticos já foi descrito em literatura: estudos in vitro em camundongos descreveram melhora do estado ansiolítico com uso de extratos da planta^[13]. A inibição da hidrolase de acilcarnitina, dessa forma, significa inibir a degradação da acilcarnitina. Esse processo permite, por conseguinte, deixar mais acilcarnitina livre no organismo, o que seria o fator associado à redução dos sintomas de ansiedade. A melhora da disfunção glutamatérgica com a reposição de L-acilcarnitina^[20] e a melhora autorrelatada de estados depressivos em pacientes doentes renais crônicos que fazem hemodiálise com essa suplementação^[21] corroboram com os resultados dessa pesquisa.

As ferramentas in sílico contribuem para sugerir possíveis mecanismos de ação do alfa-eudesmol e do gama-eudesmol ainda pouco compreendidos. As investigações da atuação dessas moléculas para bioatividade ansiolítica podem evidenciar novos fármacos e alvos candidatos, permitindo ampliação do arsenal terapêutico desses transtornos tão prevalentes em todo o mundo.

Conclusão

Na atual conjuntura das sociedades modernas, os transtornos de ansiedade tornaram-se altamente prevalentes. Associa-se a esse processo, o maior interesse pelo uso de plantas medicinais e por novos fármacos para tratamento. A partir da triagem e análise farmacofórica in sílico realizadas no presente estudo, percebe-se que o alfa e o gama-eudesmol, obtidos a partir da Magnolia obovata, possuem características farmacocinéticas e estruturais promissoras para atuar como fármacos em seres humanos, que, através da inibição da hidrolase de acilcarnitina, espera-se obter o efeito ansiolítico. Assim, os resultados obtidos neste estudo podem oferecer subsídios de futuras pesquisas com outras plantas que possuem moléculas semelhantes ao alfa-eudesmol e ao gama-eudesmol. A inibição da hidrolase de acilcarnitina pode, inclusive, tornar-se mecanismo de ação básico de novos fármacos ansiolíticos; estes com menos efeitos colaterais que aqueles mais utilizados atualmente (ISRS e IRSN), o que contribui para maior adesão ao tratamento. Os resultados aqui obtidos abrem perspectivas para testes em modelos in vitro e in vivo, visando confirmar os resultados das análises computacionais.

Fontes de Financiamento

Financiamento por recursos próprios dos autores.

Conflito de Interesses

Não há conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos nosso professor orientador Dr. Leonardo Luiz Borges por todo apoio durante os anos de desenvolvimento dessa pesquisa.

Colaboradores

Concepção do estudo: CMCV; GSB; LLB
Curadoria dos dados: CMCV; GSB; LLB
Coleta de dados: CMCV; GSB
Análise dos dados: CMCV; GSB; LLB
Redação do manuscrito original: CMCV; GSB; LLB
Redação da revisão e edição: CMCV; GSB; LLB.

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