Atividade antimicrobiana dos extratos hidroalcoólico de Eugenia uniflora L. (Myrtaceae) e Schinus molle L.(Anacardiaceae)

Resumo

O uso indiscriminado de antimicrobianos disponíveis hoje no mercado vem contribuindo para o aumento da quantidade de patógenos resistentes. Nos últimos anos, tem sido dada uma atenção expressiva à utilização de compostos antimicrobianos de origem natural. Essa crescente procura por novos compostos bioativos, parte do conhecimento de que, algumas plantas medicinais apresentam, com frequência, atividade antimicrobiana. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito antimicrobiano dos extratos hidroalcoólicos das folhas de E. uniflora (Pitanga) e S. molle (Aroeira-salsa) frente a microrganismos de interesse clínico. As folhas foram coletadas de plantas adultas, identificadas junto ao Herbário da Universidade do Vale do Sapucaí onde foi depositada uma exsicata. O extrato foi preparado pela técnica de maceração em etanol 70%. A atividade antimicrobiana foi realizada pela técnica de disco-difusão de acordo com a metodologia de Kirby-Bauer. Os microrganismos utilizados foram as cepas referências de: Escherichia coli ATCC8739, Staphylococcus aureus ATCC6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC9027, Salmonella typhimurium ATCC14028, Candida albicans ATCC90028, Candida glabrata MYA 2950, Candida Krusei ATCC6258, Candida parapsilosis ATCC 22019 e Candida utilis ATCC9950. Os extratos mostraram atividade antifúngica e antibacteriana contra os microrganismos estudados. Esses achados contribuem para um futuro emprego dessas plantas como agentes antimicrobianos.

Palavras-chave:

Plantas medicinais.

Fitoterapia.

Fungos.

Bactérias.

Abstract

The indiscriminate use of antimicrobials available on the market today has contributed to the increase in the amount of resistant pathogens. In recent years, significant attention has been given to the use of antimicrobial compounds of natural origin. This growing search for new bioactive compounds stems from the knowledge that some medicinal plants often have antimicrobial activity. Thus, the aim of this study was to evaluate the antimicrobial effect of hydroalcoholic extracts from leaves of E. uniflora (Pitanga) and S. molle (Aroeira-salsa) against microorganisms of clinical interest. The leaves were collected from adult plants, identified at the Herbarium of the University of Vale do Sapucaí where an exsiccate was deposited. The extract was prepared by the technique of maceration in 70% ethanol. Antimicrobial activity was performed using the disk-diffusion technique according to the Kirby-Bauer methodology. The microorganisms used were the reference strains of: Escherichia coli ATCC8739, Staphylococcus aureus ATCC6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC9027, Salmonella typhimurium ATCC14028, Candida albicans ATCC90028, Candida glabrata MYA 2950, Candida Krusei ATCC6258, Candida parapsilosis ATCC 22019 and Candida utilis ATCC9950. The extracts showed antifungal and antibacterial activity against the studied microorganisms. These findings contribute to a future use of these plants as antimicrobial agents.

Keywords:

Medicinal plants.

Phytotherapy.

Fungi.

Bacteria.

Introdução

O corpo humano é colonizado por uma grande quantidade de microrganismos que constituem a microbiota natural humana. Entre esses microrganismos e o organismo humano ocorre uma relação de simbiose, onde ambos são beneficiados a partir dessa associação^[1]. Entretanto, alterações no equilíbrio da microbiota local ou o comprometimento imunológico do hospedeiro podem mudar sua condição de comensal para patogênico e desencadear desde uma simples infecção até processos infecciosos profundos sendo capaz de gerar doenças em indivíduos susceptíveis^[2]. Dentre estes microrganismos destacam-se as leveduras do gênero Candida e as Enterobacteriaceae que habitam as mucosas da boca, trato intestinal e o aparelho urogenital^[3]. As Enterobactérias constituem um grupo de microrganismos presentes em vários ambientes, inclusive na microbiota humana e de outros animais, sendo que alguns destes microrganismos têm grande importância clínica^[4], já os fungos do gênero Candida são compostos por leveduras consideradas oportunistas e com quadros clínicos de infecções cutâneas, mucosas ou infecções mais profundas, como no caso das candidemias^[5]. Pacientes imunossuprimidos são mais susceptíveis às alterações que ocorrem na microbiota e o uso constante de fármacos sintéticos fazem com que estes microrganismos inócuos se tornem agentes de doenças de difícil controle[6].

Segundo a Organização Mundial da Saúde, a resistência microbiana é um grave problema de saúde pública e está associada ao aumento do tempo de internação, dos custos de tratamento e das taxas de morbimortalidade dos pacientes, sendo que, o uso dos antimicrobianos na comunidade e no ambiente hospitalar associado a práticas inadequadas de controle de infecção, são reconhecidamente fatores de risco para seleção e disseminação da resistência microbiana^[7]. Neste sentido, nos últimos anos, tem sido dada uma atenção expressiva à utilização de compostos antimicrobianos de origem natural. Essa crescente procura por novos compostos bioativos, parte do conhecimento de que, algumas plantas medicinais apresentam, com frequência, atividade antimicrobiana^[8].

A espécie Eugenia uniflora L. popularmente conhecida por pitanga, pertence a um gênero botânico da família Myrtaceae, com altura média de 6 a 12 metros, sendo muito utilizada em cultivos de pomares domésticos e seus frutos são consumidos "in natura" ou na forma de sucos[9]. Produtos naturais derivados desta planta possuem aplicações como antibacterianos, antifúngicos, imunoestimulantes e antioxidantes, especialmente na forma de extrato ou hidrolato das folhas e frutos ^[10-12].  A família Myrtaceae é uma das mais biodiversas dos neotrópicos. Espécies vegetais desta família são empiricamente aplicadas por povos convencionais para o tratamento de inúmeras complicações^[13], já que os compostos encontrados na pitanga possuem indicações terapêuticas para doenças estomacais, hipertensão, infecções de garganta, tratamento de tosse e infecções intestinais^[14].

A espécie Schinus molle L. conhecida popularmente como Aroeira-salsa, é bastante utilizada em jardins ornamentais e na arborização urbana. A espécie é pertencente à família Anacardeaceae, sendo nativa da América do sul e amplamente difundida por todo o planeta. Suas partes vegetativas são utilizadas em decocção para tratamentos de várias infecções cutâneas, doenças reumáticas, estomacais, respiratórias (quando as sementes e folhas são fervidas e o vapor é inalado), há também a descrição de alelopatia em parreiras na cidade de La Paz, Bolívia^[15,16]. O potencial antibacteriano do extrato e do óleo essencial de S. molle já foi verificado frente as cepas gram-negativas de Enterobacter aerogenes e Klebsiella pneumoniae e frente as estirpes gram-positivas de Bacillus subtilis, Micrococcus luteus e Staphylococcus aureus^[17,18]. S. molle apresenta uma composição química rica em terpenos (sesquiterpenos, sesquiterpenóides), sendo a folha a importante fonte de biomoléculas com capacidade antimicrobiana, especialmente frente importantes cepas leveduriformes e filamentosas de fungos, como Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Paracoccidiodes brasiliensis e Trichophyton quinckeanu^[19].

Logo, mediante a potencial capacidade biológica destes vegetais e a necessidade de se encontrar novas drogas eficientes frente cepas de relevante importância, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito antimicrobiano de extratos hidroalcoólicos das folhas de Eugenia uniflora L. e Schinus molle L. frente a microrganismos de interesse clínico.

Material e Métodos

Obtenção do material botânico

As folhas de E. uniflora foram coletadas de planta adulta localizada em uma área verde no município de Pouso Alegre, Minas Gerais (22º13'25,619"S; 45º54'49,758" W) e as folhas de S. molle foram coletadas também de planta adulta localizada em um canteiro central de uma avenida no mesmo município (22º13'5,172"S; 45º55'45,053" W). Ambas as coletas foram realizadas no período vespertino do mês de maio de 2021. As plantas foram identificadas junto ao Herbário UNIVÁS da Universidade do Vale do Sapucaí pela curadora profa. Dra. V.F.C. Monteiro e teve uma exsicata depositada sob os números de tombos: UNIVAS-004 (Schinus molle L.) e UNIVAS-005 (Eugenia uniflora) (FIGURA 1).

Preparo do extrato hidroalcoólico

Imediatamente após a coleta, o material vegetal foi encaminhado para o laboratório onde as folhas foram selecionadas quanto ao aspecto verde sendo descartadas folhas secas. A espécie S. molle teve os folíolos das folhas separados dos pecíolos para aquisição de dois extratos com partes vegetais diferentes. Após, o material vegetal foi limpo e lavado em água corrente e após escorrer o excesso de água, as folhas foram secas em estufa a 105ºC por 24 horas. Após esse período, o material vegetal foi então pulverizado em um moinho de facas.

O extrato foi obtido pelo método de maceração utilizando 30 g do material vegetal pulverizado e 300 mL de etanol 70% durante 7 dias com duas agitações esporádica por dia. Os frascos ficaram acondicionados em temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após este período, os extratos foram filtrados e a mistura foi submetida ao processo de remoção do álcool utilizando aparelho de Soxhlet.

Microrganismos utilizados e padronização dos inóculos

Foram utilizadas cepas referências de: Escherichia coli ATCC8739, Staphylococcus aureus ATCC6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC9027, Salmonella typhimurium ATCC14028, Candida albicans ATCC90028, Candida glabrata MYA 2950, Candida Krusei ATCC6258, Candida parapsilosis ATCC22019e Candida utilis ATCC9950.

As cepas foram reativadas após repique e incubação a 37ºC durante 24 horas. Em seguida, um pequeno fragmento das colônias foi colocado em uma solução de salina 0,9%. A suspensão resultante foi homogeneizada em agitador de vórtex durante cerca de 30 segundos. A turbidez foi ajustada ao tubo 0,5 da escala de McFarland com auxílio de um espectrofotômetro (CELM E-225 D) com absorbância de 625 nm.

Avaliação da atividade antimicrobiana por disco-difusão

A atividade antimicrobiana dos extratos foi realizada pela técnica de disco-difusão de acordo com a metodologia de Kirby-Bauer seguindo os documentos M2-A8^[20] e M44-A2^[21] com modificações. Foram utilizados discos de papel de filtro Whatman Nº 1 de 6 mm de diâmetro estéreis. O meio de cultura utilizado foi o Ágar Mueller-Hinton (HIMEDIA) para os testes com bactérias e o mesmo ágar suplementado com 2% de glicose e 0,5 µg/mL de azul de metileno para leveduras. Aproximadamente 40 mL do meio foram dispensados em placas de Petri de 100 mm de diâmetro com a finalidade de obter uma profundidade padronizada de aproximadamente 4 mm igualmente em todas as placas^[22].

Com auxílio de um swab estéril embebido na suspensão microbiana, o inóculo foi espalhado sobre toda a superfície do meio. As placas ficaram 5 minutos entreabertas para a secagem e após esse período, foi colocado no centro de cada placa, um disco de papel de filtro estéril. Em seguida, foi dispensado sobre cada disco, um volume de 5 µL do extrato hidroalcoólico. Cada placa recebeu um disco com uma amostra do extrato, e o teste foi realizado em triplicatas. As placas foram incubadas a 35°C por 24 horas (bactérias) e 48 horas (leveduras) e após esse período, os halos foram mensurados com auxílio de um paquímetro^[22].

Análise estatística

Os dados obtidos nas avaliações de difusão em ágar foram submetidos à análise de variância (ANOVA), sendo as médias das medidas dos halos comparadas pelo teste Tukey, ambos a 5% de significância, utilizando-se o Software R. 2.5.1.

Resultados e Discussão

Neste estudo, os extratos hidroalcoólicos das folhas de E. uniflora e dos folíolos e dos pecíolos das folhas de S. molle mostraram atividade antifúngica e antibacteriana contra os microrganismos estudados como mostra a TABELA 1.

O extrato das folhas de E. uniflora mostrou atividade antifúngica e antibacteriana e houve diferença estatística nos tratamentos com valor de p < 0,001 (FIGURA 2), sendo que C. krusei foi o microrganismo mais susceptível seguido de E. coli (FIGURA 3). Não houve diferença estatística na média dos halos de inibição de S. aureus, C. parapsilosis, C. utilis e C. albicans.

Nos estudos de Fiúza et al.^[23], o extrato etanólico das folhas de Eugenia uniflora foi satisfatório, inibindo bactérias Gram negativas e fungos do gênero Candida. Utilizando óleo essencial, Martins^[24], verificou inibição in vitro de cepas de Candida albicans, entretanto para a espécie de Candida Krusei os resultados foram negativos. No estudo de Mendonça et al.^[25], ao analisar a atividade antibacteriana do extrato hidroalcoólico das folhas de Eugenia uniflora, os autores observaram inibição frente às cepas de S. aureus, E. coli e Pseudomonas sp., sendo este resultado mais satisfatório quando comparados com os resultados utilizando extrato etanólico.

Quanto aos extratos dos folíolos e dos pecíolos das folhas de S. molle L. os resultados mostraram atividade antifúngica contra C. krusei. A atividade antibacteriana contra E. coli foi verificada na presença do extrato do folíolo e de S. aureus na presença do extrato do pecíolo, para os demais microrganismos não foram produzidos halos de inibição e houve diferença estatística com p < 0,001 (FIGURA 4).

Nos estudos de Calderón Condor^[18], as cepas de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa tiveram inibição frente ao extrato etanólico de Schinus molle L. conforme a concentração de etanol no processo de extração. Já no estudo de Requejo Quispe^[17], os óleos essenciais extraídos das folhas e frutos de Schinus molle L. demonstraram atividade antimicrobiana significativa frente a bactérias Gram positiva e Gram negativa, caracterizando um antimicrobiano promissor. Comparando o óleo essencial dos frutos de Schinus molle L. a uma concentração de 100% com o fármaco fluconazol, Zambrano^[19], destaca a atividade antifúngica do óleo essencial frente a leveduras do gênero Candida.

O presente estudo aponta uma alternativa à necessidade de novas opções terapêuticas contra agentes microbianos. Ainda há a necessidade de que novos estudos sejam realizados a fim de avaliar e garantir a eficácia dos extratos frente a diferentes espécies de microrganismos e a possível interação com diferentes antimicrobianos.

Sendo assim, voltam-se os olhares aos fitoterápicos que são caracterizados por serem compostos naturais complexos e voláteis e são obtidos de várias partes das plantas, como folhas, flores ou frutos^[10]. Segundo Hasenclever et al.^[26], a fitoterapia representa a possibilidade de ampliação de opções terapêuticas. Constitui importante fonte de inovação em saúde e pode fortalecer ainda mais a inovação, a produção e exploração da rica biodiversidade brasileira. Para Abílio et al.^[27], a fitoterapia é economicamente viável, diminui as reações adversas, apresenta eficácia e está se tornando um meio terapêutico promissor.

Conclusão

Os extratos dos folíolos e dos pecíolos de Schinus molle L., como também as folhas da Eugenia uniflora L.possuem atividade antimicrobiana, no entanto, o potencial fitoterápico destas plantas devem ser melhor estudados e compreendidos por outros métodos. Esses achados contribuem para um futuro emprego dessas plantas como fitoterápico em tratamento preventivo ou alternativo contra infecções microbianas.

Fontes de Financiamento

Não houve financiamento.

Conflito de Interesses

Os autores declaram não existir nenhum conflito de interesse.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Herbário UNIVÁS da Universidade do Vale do Sapucaí, em particular ao José Donizeti dos Reis pela valiosa assistência técnica, e à curadora, professora Dra. Vanessa da Fontoura Custódio Monteiro.

Colaboradores

Concepção do estudo: LFP; FLPF; ILM.
Curadoria dos dados: FLPF; ILM; LFP.
Coleta de dados: FLPF; ILM.
Análise dos dados: LFP; TCR.
Redação do manuscrito original: FLPF; ILM; LFP.
Redação da revisão e edição: FLPF; ILM; TCR; LFP.

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