Petiveria alliacea L. (Phytolaccaceae) frente Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia e Staphylococcus aureusResumo
Neste estudo, avaliou-se a atividade antibacteriana das folhas de Petiveria alliacea L. (Phytolaccaceae), utilizando seu extrato hidroalcoólico sobre cepas de Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia e Staphylococcus aureus em experimento conduzido in vitro. O extrato produzido e antibióticos controle (Ampicilina, Cloranfenicol e Sulfametazol + Trimetropim), foram avaliados quanto a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM). Estabeleceu-se o perfil de susceptibilidade dos microrganismos a antibacterianos comerciais. As análises de CIM demonstraram que o extrato de P. alliacea possui atividade antimicrobiana sobre as linhagens de A. baumanni e B. cepacia avaliadas, sendo a CIM determinada em 2500 µg mL-1. Para 56 % das linhagens de S. aureus avaliadas (9 de 16), não houve inibição com CIM > 2500 µg mL-1, contudo, houve inibição frente as demais cepas (7 de 16). A linhagem S. aureus 1 apresentou melhor resultado, com CIM de 156,25 µg mL-1, seguido das cepas 10 e 66, com CIM de 625 µg mL-1 e, por fim, cepas 13, 15, 21 e ATCC 6538, com CIM de 1250 µg mL-1. Os resultados das análises de CBM evidenciam a atividade bacteriostática da solução hidroalcoólica das folhas de Petiveria alliacea, enquanto as análises de CIM confirmam o seu potencial antimicrobiano.
Palavras-chave Antibacterianos; Plantas medicinais; Fitoterapia
Abstract
In this study, the antibacterial activity of Petiveria alliacea L. (Phytolaccaceae) leaves was evaluated, using its hydroalcoholic extract on strains of Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia and Staphylococcus aureus in an in vitro experiment. The extract produced and control antibiotics (Ampicillin, Chloramphenicol and Sulfamethazol + Trimethopim) were evaluated for Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC). The susceptibility profile of microorganisms to commercial antibacterials was established. MIC analyses demonstrated that the Petiveria alliacea extract has antimicrobial activity against the A. baumanni and B. cepacia strains evaluated, with MIC determined at 2500 µg mL-1. For 56% of the S. aureus strains evaluated (9 out of 16), there was no inhibition with MIC > 2500 µg mL-1, however, there was inhibition against the other strains (7 out of 16). The S. aureus 1 strain showed the best result, with a MIC of 156,25 µg mL-1, followed by strains 10 and 66, with a MIC of 625 µg mL-1 and, finally, strains 13, 15, 21 and ATCC 6538, with a MIC of 1250 µg mL-1. The results of the CBM analysis demonstrate the bacteriostatic activity of the hydroalcoholic solution of Petiveria alliacea leaves, while the MIC analyses confirm its antimicrobial potential.
Keywords Anti-Bacterial Agents; Medicinal Plants; Phytotherapy
Introdução
Infecções causadas por agentes de origem bacteriana apresentam elevada incidência não somente no Brasil, como também no cenário mundial. Sendo que, as infecções mais frequentes são associadas ao trato urinário (ITU), ocasionadas por agentes infecciosos como a Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae; infecções do trato gastrointestinal onde se ressalta Campylobacter spp., Escherichia coli, Salmonella spp. e Shigella spp.; e trato respiratório inferior e superior com prevalência de cepas de Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus[1,2]. A espécie Burkholderia cepacia (B. cepacia) pertencente ao Burkholderia cepacia complex (Bcc), um patógeno oportunista que aflige principalmente pacientes com fibrose cística e imunodeprimidos, também está entre os microrganismos de grande relevância na área clínica, considerando seu potencial de causar um quadro de pneumonia necrosante ou até mesmo uma sepse[3].
Em 2018, a Organização mundial de Saúde também classificou as cepas de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos, como prioridade crítica para pesquisas e desenvolvimentos de tratamentos[4].
Petiveria alliacea é uma planta arbustiva ou herbácea, nativa da floresta amazônica e regiões de clima tropical pertencente à família Phytolaccaceae de relevância na medicina tradicional e rituais religiosos por suas atividades anticarcinogênica, antiespasmódica, analgésica, antimicrobiana, diurética e hipoglicemiante[5-8]. Adicionada ao Programa de Pesquisas de Plantas Medicinais da Central de Medicamentos desde 2006[9] pode ser considerada uma opção para novos estudos de antimicrobianos e, também, desenvolvimento de novos medicamentos fitoterápicos que atuem sobre bactérias que causam doenças infecciosas nos seres humanos.
No extrato hidroalcoólico, constatou-se a presença de diferentes metabólitos, entre eles: flavonoides como Leridal e Petiveral[10]; polissulfetos como Dibenzil trissulfeto (DTS)[10]; terpenoides como ácido barbinervico e isoarborinol[10]; e tiossulfinatos como o tiobenzaldeído-óxido [11].
Estudo qualitativo realizado por Souza[12], ao analisar a classe química dos metabólitos secundários presentes no extrato hidroalcoólico da Petiveria alliacea, constatou a presença de alcaloides, flavonoides e terpenoides, enquanto na análise do extrato aquoso, houve presença de alcaloides, cumarina, flavonoides, saponinas e taninos, fato que evidenciou a diferença de metabólitos de acordo com a preparação do extrato.
O objetivo desse estudo foi avaliar in vitro a atividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólico de Petiveria alliacea frente cepas de Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia e Staphylococcus aureus, estocadas em banco de linhagens microbianas mantido no laboratório de Biologia Molecular da Unidade de Biotecnologia da Universidade de Ribeirão Preto.
Material e Métodos
a) Aspectos éticos
O material genético utilizado na pesquisa foi registrado no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen), sob números: A87960D, A566329, AE8C0E6, A988973, A22691E, A64FE63, AA351E8, A7BB473, A8D2429, AA3D649, A88F3EF, A9E40CE, A5E43F9, ABA55DF, AFB2D81, AC4297B, AD26AA6, ADAA18D, A37F338, A6EC803, A85BBF2, A6B8512, AA12235, A74A7C0, A2FB960, A0EB0E9, ACCC9BA, A7B7DC9, A660EB0. Os resíduos da pesquisa devidamente descartados em lixo de classificação A1 e classificação E, segundo a RDC 222/2018 da ANVISA. As metodologias empregadas são validadas e foram seguidas de forma a manter a confiabilidade do estudo e sua reprodutibilidade.
b) Desenho, local do estudo e período
Trata-se de um estudo experimental pré-clínico in vitro, realizado na Universidade de Ribeirão Preto (São Paulo), no Laboratório de Biologia Molecular da Unidade de Biotecnologia, no período de junho de 2023 a dezembro de 2023.
c) Amostra e critérios de inclusão e exclusão
Entre as cepas armazenadas em banco de linhagens microbianas mantido no laboratório de Biologia Molecular da Unidade de Biotecnologia da Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP), identificadas com gênero e numeração/especificação interna própria ou suas devidas numerações da American Type Culture Collection (ATCC) para as cepas padronizadas externamente, foram incluídas neste estudo as linhagens que apresentaram boa viabilidade, pureza adequada e associadas a infecções respiratórias. Excluiu-se aquelas que apresentavam viabilidade comprometida, traços de contaminação ou não eram patógenos infectantes do trato respiratório.
Foram utilizadas, portanto, dezesseis cepas pertencentes à família Staphylococcaceae, sendo elas: Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Staphylococcus aureus 1, Staphylococcus aureus 5, Staphylococcus aureus 10, Staphylococcus aureus 11, Staphylococcus aureus 12, Staphylococcus aureus 13, Staphylococcus aureus 15, Staphylococcus aureus 20, Staphylococcus aureus 21, Staphylococcus aureus 66, Staphylococcus aureus 100, Staphylococcus aureus 110, Staphylococcus aureus 112, Staphylococcus aureus 114 e Staphylococcus aureus 118.
Além de um microrganismo pertencente à família Moraxellaceae: Acinetobacter baumannii (ATCC 14293) e dois da família Burkholderiaceae: Burkholderia cepacia (ATCC 17759) e Burkholderia cepacia (ATCC 25416).
d) Protocolo do estudo
Reativação dos microrganismos selecionados
O meio de cultura utilizado para reativação das cepas foi o Ágar Triptona de Soja (TSA), com incubação a 37°C durante 24 horas, para, após o período percorrido, realizar o repique utilizando Ágar Mueller-Hinton (MH) através do método de estriamento, também com incubação das placas semeadas a 37°C durante 24 horas em aerobiose para posterior avaliação da viabilidade.
Testes de sensibilidade microbiológica
A execução dos testes de difusão em disco teve como base o método do antibiograma recomendado pelo Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI), descrito na Bula de Bancada de Diagnósticos Microbiológicos Especializados (DME) edição de 2023[13,14] e consiste inicialmente da preparação de meio Mueller-Hinton Agar (MH) conforme as instruções do fabricante, sem aditivos, sendo 38 g de ágar para 1000 mL de água ultrapura do tipo l, obtida pelo equipamento de purificação Milli-Q® da Merck Group.
O meio foi esterilizado em autoclave a 121°C por 15 minutos. Após esterilização, o meio foi submetido a resfriamento a 45°C em banho-maria com água circulante (PrecisionTM) e vertido dentro de uma capela de fluxo laminar em placas de Petri de 150 mm (cerca de 60 mL/placa).
O preparo da solução bacteriana seguiu o padrão de Kirby e Bauer[15] para a turbidez correspondente a 0,5 da escala de Mac Farland. A semeadura da solução no meio de cultura foi realizada com auxílio de um swab de algodão não tóxico estéril embebido da solução. Os discos de antibióticos foram aplicados sobre as placas recém inoculadas com base em escantilhões elaborados a partir das indicações do CLSI para cada família supracitada, sendo em seguida incubadas a 37°C por 24 horas. Após este período, foi observado o crescimento de colônias e realizada a medição dos halos de inibição com um medidor em mm, incluindo o diâmetro dos discos.
Obtenção do extrato vegetal
Para o preparo do extrato hidroalcoólico, foi aplicado o método tradicional de alcoolatura utilizando 200 g de folhas frescas da espécie medicinal Petiveria alliacea colhidas na estação primavera, sob influência da lua Minguante e Crescente no período de 05 e 17 de outubro de 2023, sendo utilizada a relação droga extrato (RDE) 2:8. O solvente empregado para a extração foi o álcool de cereais a 80% v/v, preparado com álcool de cereais (CereAlcool® - Lote: L20H171415) e água ultrapura do tipo l, obtida pelo equipamento de purificação Milli-Q® da Merck Group.
A extração seguiu de forma contínua durante 7 dias e, ao final, o extrato obtido foi filtrado em papel filtro e submetido a concentração e retirada do solvente através do equipamento rotaevaporador 10 CONTROL (IKA Works®) a uma temperatura de 40°C, 55 RPM e 55 mbar.
O extrato foi então mantido em capela de exaustão para redução do volume de solvente restante, seguido de congelamento a -20°C e liofilização para obtenção do extrato em pó. Sendo que, para a ressolubilização do pó e obtenção de um extrato com concentração igual a 5,00 mg mL-1, foi utilizado os seguintes compostos e quantidades: 450 mg do extrato em pó, 8 mL de álcool de cereais, 100 μL de tween 80 e 81,9 mL de salina 0,9% na mistura que foi, por fim, filtrada a vácuo, como ilustrado na FIGURA 1.
Preparo dos inóculos
Os inóculos preparados para a determinação da CIM foram preparados coletando de 3 a 4 colônias e solubilizando-as em 4 mL de salina 0,9%, com agitação em vórtex para homogeneizar a solução bacteriológica. Para a padronização da concentração dos inóculos foi utilizado espectrofotômetro da marca ÚNICO®, com comprimento de onda de 550 ɳm e faixa de absorbância padronizada em 0,100 – 0,125 Abs550 ɳm.
Análise da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A análise de CIM seguiu o protocolo do Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI), descrito na Bula de Bancada de Diagnósticos Microbiológicos Especializados (DME) edição de 2023[14], utilizando placa de 96 poços, sendo que a maior concentração do extrato testada foi de 2500 μg mL-1 e a menor 156,25 μg mL-1a partir de uma diluição seriada.
As análises empregando os antibióticos controle foram executadas do mesmo modo, apenas substituindo o extrato vegetal pelos agentes escolhidos, sendo que, foi utilizado Ampicilina (60 μg mL-1) para a cepa de A. baumannii, Cloranfenicol (60 μg mL-1) para cepas de S. aureus e Sulfametazol + Trimetropim (100 μg mL-1) para as cepas de B. cepacia.
Todas as placas foram incubadas a 37°C por 24 horas e a leitura realizada 16 horas após a incubação. A determinação das CIMs teve como base a coloração apresentada após adição de 25 μL de resazurina a 0,1% em cada poço, com mais 60 minutos de incubação a 37°C, seguida de leitura.
Análise da Concentração Bactericida Mínima (CBM)
A determinação da CBM seguiu com base na metodologia desenvolvida por Hernandes et al.[16] onde foi coletado, a partir das placas de 96 poços utilizadas para determinar a CIM, uma alíquota de 10 μL dos poços que não apresentaram turvação (ausência de crescimento), e 10 μL dos poços contendo os controles do extrato e do meio. E este material foi transferido para uma nova placa contendo novo meio de cultura MH líquido e as placas incubadas por 24 horas a 37°C, sendo analisado se houve ou não crescimento bacteriano nos poços após adição de 25 μL de resazurina a 0,1% em cada poço, com mais 60 minutos de incubação a 37°C, seguida de leitura.
e) Análise dos resultados e estatística
Os resultados obtidos nas análises de Concentração Inibitória Mínima e Concentração Bactericida Mínima foram tabulados para, posteriormente, os valores observados na utilização do extrato vegetal hidroalcoólico serem comparados com os valores observados com o uso dos antibióticos comerciais, a fim de determinar a eficácia do extrato produzido.
Resultados e Discussão
A partir da análise dos resultados dos testes de difusão em disco, concluiu-se que as cepas de S. aureus estudadas, possuem sensibilidade aos agentes antimicrobianos Ciprofloxacina, Cloranfenicol, Doxacilina e Sulfametazol + Trimetropim (quatro agentes dos dezoito testados). Sendo o Cloranfenicol utilizado como antibiótico comercial neste estudo.
Através dos testes de CIM e CBM foi possível determinar a concentração mínima do extrato para que o efeito inibitório em cada espécie de microrganismo e, também, evidenciou que o extrato de Guiné preparado possui efeito bacteriostático e não bactericida frente aos microrganismos avaliados, os valores obtidos constam nas TABELAS 1 e 2.
Através dos testes de susceptibilidade microbiológica realizados neste trabalho, nas condições ensaiadas, foi possível determinar que as cepas de S. aureus avaliadas foram resistentes a 84% dos antibióticos recomendados para seu tratamento, apresentando alto perfil de resistência no panorama geral. Os testes de susceptibilidade para as linhagens de A. baumannii e B. cepacia não foram realizados por se tratar de cepas ATCC e com sabido perfil de resistência aos antimicrobianos comerciais, sendo, portanto, realizadas consultas em literaturas e estudos previamente publicados para decidir aquele antibacteriano ao qual essas linhagens apresentam sensibilidade. Deste modo, escolheu-se o uso da Ampicilina e Sulfametazol + Trimetropim, sendo comprovada sua eficácia durante a execução prática deste trabalho[17,18].
As análises de CIM evidenciaram que o extrato das folhas de P. alliacea possui atividade antimicrobiana contra microrganismos patogênicos, haja vista que a faixa de concentração do extrato que as cepas avaliadas apresentaram sensibilidade foi de 2500 µg mL-1 para as cepas de A. baumannii e B. cepacia, enquanto para a espécie S. aureus houve inibição nas linhagens: S. aureus 1, que apresentou melhor resultado, com CIM de 156,25 µg mL-1, seguido das cepas 10 e 66, com CIM de 625 µg mL-1e, por fim, 13, 15, 21 e ATCC 6538 com CIM de 1250 µg mL-1. Não se observou inibição nas concentrações ensaiadas para as cepas S. aureus 5, 11, 12, 20, 100, 110, 112, 114 e 118, sendo esta superior à 2500 µg mL-1. Quanto aos resultados das análises de CBM mostraram que a solução hidroalcoólica da P. alliacea possui atividade bacteriostática, inibindo o crescimento microbiano, sem gerar morte celular.
Consultas em literaturas publicadas no período de 2003 a 2024 foram realizadas para fins comparativos, no entanto, notou-se grande variação entre os resultados dos estudos. Guedes et al.[19] prepararam e avaliaram diferentes extratos das folhas de Guiné, e constataram que a solução polar, preparada por este grupo de trabalho empregando etanol 70% como solvente, possui CIM de 3,96 mg mL-1 para Staphylococcus aureus. Enquanto Antunes et al.[20] obtiveram concentração inibitória de 250 mg mL-1 para S. aureus (ATCC 6538). Olomieja et al.[21] observaram valores de 6,25 µg mL-1 para CIM de cepas de S. aureus, também utilizando extratos polares das folhas. O estudo mais recente, publicado em 2024 por Henrique et al.[8], no qual o extrato bruto de Petiveria alliacea foi ensaiado frente a espécie Staphylococcus aureus ATCC 25923, demonstrou que não houve inibição nas concentrações testadas (CIM >10.000 µg mL-1), enquanto nas frações de acetato de etila e n-butanólica a CIM foi de 10.000 µg mL-1, e na fração aquosa a concentração inibitória foi de 25.000 µg mL-1. Havendo assim, um espectro ação que varia de 6,25 – 250 mg mL-1 nas CIMs determinadas.
Para as linhagens de A. baumanni e B. cepacia, não há estudos documentados em literatura para comparação efetiva quanto à sua atividade antimicrobiana por meio de análises de CIM com o extrato de Petiveria alliacea, sendo este o primeiro relato da atividade de extrato da espécie frentes estas espécies.
Os resultados obtidos neste trabalho apresentaram concentração inibitória mínima (CIM) variável entre 156,25 e 2500 µg mL-1, para S. aureus. Porém, estas mesmas estirpes foram inibidas pelos antibióticos industrializados em concentrações menores, fato que mostra uma menor efetividade do extrato vegetal em comparação aos agentes do grupo controle.
Essa menor efetividade do extrato vegetal em comparação com o grupo controle também pode ser observada com as outras cepas utilizadas no estudo, como, por exemplo, as cepas de Acinetobacter baumannii (ATCC 14293) e Burkholderia cepacia (ATCC 17759), que apresentaram inibição do crescimento microbiano em 2500 µg mL-1 quando utilizado o extrato hidroalcoólico de P. alliacea e efeito inibitório em 15 µg mL-1 e 6,25 µg mL-1, respectivamente, quando utilizado os antibióticos industrializados (Ampicilina para A. baumannii e Sulfametazol + Trimetropim para B. cepacia).
Para a determinação da CIM, foi realizado um estudo teórico para encontrar a melhor forma de preparo do extrato de P. alliacea., onde se verificou superioridade dos extratos hidroalcoólicos com relação à eficácia contra bactérias e, assim, iniciou-se a produção do extrato hidroalcoólico da P. alliacea.
Quanto à solubilidade do extrato, o extrato liofilizado em pó, nas quantidades testadas, não apresentou boa solubilidade em água, salina 0,9% ou tween 80, mas possuiu boa solubilidade em etanol. Deste modo, a porcentagem máxima de álcool utilizado na ressuspensão do extrato (8,8%), foi utilizada como controle dos ensaios microbiológicos.
A escolha de usar o extrato seco ressuspendido foi motivada, em parte, por limitar a quantidade de etanol a ser utilizada na iminência de produção de um medicamento fitoterápico comercial.
No entanto, a solubilização do extrato em pó pode ter sido complicada pela presença de compostos não hidroxilados, como o Leridal, um composto apolar encontrado nos extratos de P. alliacea em estudo anterior que utilizou etanol como principal solvente de extração[10].
Conclusão
A avaliação da atividade antimicrobiana da Petiveria alliacea foi o foco deste trabalho, pois, tendo em vista seu efeito expressivo sobre fungos, o potencial de atuação sobre bactérias é um tópico negligenciado, por isso, não adequadamente explorado, embora já existam estudos indicando sua atuação sobre microrganismos patogênicos.
No presente estudo, pôde-se constatar um potencial antibacteriano por meio da testagem em 19 microrganismos, selecionados com foco em espécies de maior incidência no contexto de infecções bacterianas em seres humanos. Sendo estes microrganismos pertencentes a diferentes famílias.
Além de que, através da constatação do alto perfil de resistência aos antibióticos disponíveis atualmente, das espécies utilizadas, os resultados obtidos reforçam o potencial da espécie Petiveria alliacea sobre estirpes de Staphylococcus aureus.
Agradecimentos
Agradecimentos à Unidade de Biotecnologia, Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP), Ribeirão Preto – São Paulo, pela estrutura e materiais cedidos para a realização deste estudo.
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Fontes de Financiamento:
Nenhum.
Datas de Publicação
- Publicação nesta coleção
06 Jan 2026 - Data do Fascículo
Fev 2026
Histórico
- Recebido
28 Nov 2024 - Aceito
05 Nov 2025
Fonte: Autoria própria.