Atividade antiproliferativa do composto bioativo de Silybum marianum em linhagem celular de melanoma humano com mutação BRAF: potencial para reposicionamento terapêutico

Introdução

Atualmente o reposicionamento de drogas aprovadas é um tema que vem ganhando destaque na literatura, principalmente porque seria uma forma mais barata e rápida de estar disponível aos pacientes¹, uma vez que essas moléculas já passaram por todos os testes regulamentares de biossegurança, eficácia, biodistribuição, toxicidade, dentre outros, quando da liberação para o uso clínico original.

Entretanto, o caminho não é tão simples assim, pois no que se refere ao tratamento do câncer, apenas o trióxido de arsênio e o ácido all-trans-retinóico, usados desde 1962 para tratar afecções cutâneas, foram reposicionados especificamente para tratamento de leucemia promielocítica aguda desde 2000¹.

Por outro lado, verifica-se que fitoterápicos vem ocupando espaço como medicamentos coadjuvantes no tratamento do câncer, embora estudos que se destinam ao seu reposicionamento para comprovar uma possível atividade antitumoral ainda sejam esparsos. Um deles que têm atraído nosso interesse, a erva floral medicinal Cardo mariano (Silybum marianum (L.) Gaertn.), cujo extrato seco do fruto é indicado como fitoterápico regulamentado pela ANVISA, nas preparações sob forma farmacêutica sólida ou líquida para uso oral²,³ em medicamentos como Legalon^®, Steaton^®, Silimalon^® e Forfig^®.

Os estudos mais recentes sobre essa planta, vem apontando outras atividades biológicas para além da sua conhecida e aprovada atividade hepatoprotetora. Dentre essas, destaca-se a atividade antiproliferativa, verificada em diversos estudos in vitro e pré-clínicos de canceres de pele, hepático, mama, ovário, prostata, pulmão e outros⁴-⁷.

O princípio ativo encontrado nas folhas, sementes e frutos é a Silimarina, nome genérico dado ao extrato seco que contém uma mistura de flavolignanos, flavonoides e compostos polifenólicos, onde a Silibinina é principal componente bioativo⁸.

Especificamente, em relação ao melanoma, verificou-se que há poucos estudos até a presente data, sendo que não se encontrou nenhum estudo clínico registrado na plataforma ClinicalTrials.gov, da National Library of Medicine (NLM) nos Estados Unidos. Estudos empregando linhagens celulares de melanoma murino ou humano (SK-MEL-5, SK-MEL-28, A375), in vitro ou em camundongos imunocompetentes, demonstraram efeitos inibitórios da Silibinina no crescimento celular⁹-¹¹. Uma formulação em hidrogel termossensível, apresenta potencial para aplicação tópica¹², o que seria importante para melanoma cutâneo.

Sabe-se que, cerca de 60% dos casos de melanoma maligno diagnosticados, apresentam mutações no protooncogene BRAF¹³,¹⁴. As linhagens celulares comerciais de melanoma humano, foram estabelecidas de amostras de pacientes e expressam o gene wild-type ou mutante BRAF, conforme se pode verificar no catálogo disponibilizado pelo Memorial Sloan Kettering Cancer Institute¹⁵. Tais estudos têm indicado que a presença ou não do gene mutante pode influenciar na resposta ao tratamento com a Silibinina¹¹.

Visando ampliar a compreensão do efeito de Silibinina no melanoma, utilizou-se a linhagem SK-MEL-37, uma vez que não há estudos sobre a atividade antiproliferativa de Silibinina empregando tal linhagem celular. Tal linhagem, além de apresentar o gene mutante BRAF, é amelanótica, o que a diferencia das linhagens já avaliadas na literatura.

Material e Métodos

Cultura de células e manutenção da linhagem celular

As células de melanoma humano metastático amelanótico da linhagem SK-MEL-37 empregadas neste estudo foram obtidas por doação de Dr. Loyd J. Old do Instituto de Câncer Memorial Sloan-Kettering, New York, USA. As células foram semeadas em frascos de 75 cm² em meio de cultura MEM (Cultilab, Campinas, Brasil), suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (Cultilab, Campinas, Brasil), 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina (Gibco BRL, Argentina) e 0,25 µg/mL de Fungizona (Gibco BRL, Argentina) e mantidas em incubadora úmida com condições de 5% de CO₂ e 37°C. Para os experimentos, as células foram semeadas em placas de 24 poços, e as concentrações celulares foram calculadas assumindo-se um tempo de duplicação de 30 horas, de forma a garantir o crescimento exponencial durante todo o tempo de tratamento com a Silibinina.

Preparação da solução de silibinina

O extrato de Silibinina [2,3-Dihydro-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-(hydroxymethyl)-6-(3,5,7-trihydroxy-4-oxobenzopyran-2-yl)benzodioxin, Silybin)] com ≥ 98% de pureza (HPLC) foi obtida da Sigma Aldrich. O composto foi armazenado em temperatura de -20°C. As soluções de Silibinina usadas nos experimentos foram preparadas por dissolução de massa adequada em DMSO.

Medida da atividade antiproliferativa de Silibinina

Inicialmente realizou-se um acompanhamento visual, verificando-se em microscópio invertido, o grau de desprendimento das células do fundo da placa de cultivo, fato indicativo da citotoxicidade do tratamento. Neste procedimento, as células de melanoma (SK MEL-37) foram semeadas em placas de com 24 poços (Nunc Brand Products, USA) e tratadas após 24 horas (tempo suficiente para adesão das células ao fundo da placa) com diferentes concentrações de Silibinina. Após 48 horas de incubação, as placas foram diretamente observadas em microscópio óptico (Eclipse TE 2000S, NIKON) e fotografadas. A seguir, procedeu-se à avaliação da viabilidade celular por meio do ensaio de MTT, com algumas variações em relação ao protocolo original. Este ensaio se baseia na medida da atividade da enzima desidrogenase mitocondrial, a qual é capaz de metabolizar o reagente brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (conhecido como MTT) em um composto colorido denominado formazan (cor roxa), que pode ser solubilizado e quantificado por espectrofotometria (570 nm). Dessa forma, os eventos metabólicos de apoptose ou necrose que levam a uma diminuição na viabilidade da cultura celular, podem ser quantificados. O formazan produzido pelas células está diretamente correlacionado com o número de células viáveis(¹⁵)Em nossas mãos, o melhor solvente para a solubilização do formazan e estabilidade dessa solução foi o metanol.

O número de células semeadas foi calculado de tal forma que as células atingissem a confluência ao término de 72 horas. Após 24 horas da semeadura, as células foram tratadas com diferentes concentrações da solução de Silibinina em quadruplicata e incubadas por um período de 48 horas. Ao término do período de incubação, acrescentou-se 50 µL de solução de MTT (5 mg/mL, Calbiochem, USA), incubando-se novamente por duas horas para metabolização do MTT. A seguir, o meio foi totalmente descartado, acrescentando-se 300 µL de metanol gelado (Vetec) para a solubilização do formazan formado. Alíquotas de 100 µL foram transferidas para uma placa de 96 poços para leitura da absorbância a 570 nm em leitor de microplacas (ELX-800, Bio-Teck Instrument, INC). Para a construção do gráfico de Porcentagem de viabilidade celular x concentração e o cálculo do IC₅₀ (Concentração Inibitória para 50% das células), utilizou-se o Programa GraphPad Prism, versão 4.00 para Windows, da GraphPad Software, San Diego, USA, www.graphpad.com. Os valores de absorvância obtidos no tratamento com as diferentes concentrações de Silibilina, foram normalizados para os valores obtidos com o solvente DMSO (B) para obtenção da porcentagem de viabilidade celular (C) através da equação: C = A/B x 100 para todas as concentrações estudadas. Os resultados foram obtidos de três experimentos independentes.

Resultados e Discussão

As células semeadas foram fotografadas em microscópio óptico (NIKON) para a observação da ação da solução de Silibinina, após 72 horas de incubação. Foi possível observar mudanças morfológicas nítidas entre as células tratadas (FIGURA 1 C-F) e o controle (FIGURA 1 A-B). As células não tratadas ou tratadas apenas com o solvente, apresentam-se aderidas à placa de cultura, bem distribuídas e com prolongamentos irregulares em várias direções, aspectos característicos do melanoma (SK MEL-37) em cultura. Já as células tratadas se caracterizaram pelo arredondamento celular, presença de vacúolos e fragmentação nuclear e desprendimento (perda de aderência ao substrato), sendo que, essas características se tornaram mais evidentes à medida que se aumentava a concentração de Silibinina.

Para análise da viabilidade celular, as células foram tratadas por 48 horas com as seguintes concentrações de Silibinina: 41, 104, 207 e 518 µM. O valor do IC₅₀ encontrado foi de 240 µM, obtido por meio curva dose-resposta demonstrada na FIGURA 2. As células não tratadas apresentaram 100% de viabilidade.

Os resultados indicaram que a Silibinina apresentou efeito antiproliferativo em células da linhagem SK-MEL-37, com um IC₅₀ de 240 µM. Esse valor é maior do que os relatados em estudos anteriores, que avaliaram o efeito da Silibinina em células SK-MEL-5 e SK-MEL-28, ambas com mutação no gene BRAF, sugerindo IC₅₀ entre 40 e 80 µM, conforme observado nos histogramas de viabilidade celular apresentados. Em contraste, na linhagem SK-MEL-2, que não apresenta mutação no gene BRAF, a Silibinina não demonstrou efeito antiproliferativo significativo. Esses achados sugerem uma possível influência da mutação no gene BRAF na resposta à Silibinina. No entanto, como a linhagem SK-MEL-37 utilizada neste estudo também expressa BRAF mutante, a diferença de IC₅₀ não pode ser completamente explicada apenas por essa mutação.

Adicionalmente, estudos prévios demonstraram que a presença ou ausência da enzima tirosinase pode alterar a resposta a drogas em melanomas melanóticos e amelanóticos. Em células SK-MEL-28, a ausência do gene da tirosinase em células transfectadas (amelanóticas) modificou significativamente o efeito da Rutina¹⁶, indicando que a tirosinase pode atuar como moduladora da eficácia de determinadas substâncias em linhagens melanóticas. Embora esse mecanismo não tenha sido diretamente avaliado para a Silibinina, ele sugere que fatores relacionados à melanogênese e ao metabolismo de drogas podem desempenhar um papel importante na variabilidade da resposta observada.

Conclusão

A Silibinina demonstrou potencial antiproliferativo em células de melanoma humano com mutação no gene BRAF, utilizando uma linhagem amelanótica. A observação morfológica indicou alterações compatíveis com morte celular, reforçando seu papel como candidato promissor para futuras investigações no contexto do tratamento de melanomas.

Agradecimentos

Ao Instituto de Ciências Biológicas e ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da UFG, por meio da Pró-reitora de Pesquisa e Pós-Graduação para compra de materiais e insumos necessários ao desenvolvimento do estudo.

Referências

Datas de Publicação

Histórico