Avaliação da capacidade antioxidante, quantificação de fenólicos e perfil UV do extrato acetato de etila de Protium spruceanum Benth. Engl

Introdução

A família botânica Burseraceae, é composta por 19 gêneros e 750 espécies de árvores e arbustos caracterizados pela casca lisa, escamosa, aromática e por ductos localizados na casca e folhas que produzem resina[¹,²]. Dentre os gêneros da família, Protium tem maior heterogeneidade e o principal gênero encontrado na América do sul, com 175 espécies conhecidas distribuídas na região neotropical[³]. No Brasil, o gênero é representado por 86 espécies, das quais 19 são endêmicas[⁴].

A espécie Protium spruceanum Benth. Engl da família Burseraceae, popularmente conhecida como Almescla, Almecegueira ou Breu[⁵], é uma planta utilizada na medicina tradicional como analgésica e anti-inflamatória[⁶]. A atividade anti-inflamatória associada a espécie foi estuda, no qual a fração hidrometanólica controlou os níveis de citocinas pró-inflamatórias, o qual pode estar associado a presença de flavonoides de forma oligomérica, polimérica e glicosilados[⁷]. Na literatura, ainda é relatada a atividade antibacteriana contra nove bactérias patogênicas para o extrato bruto e fração acetato de etila e hidrometanólica[⁸].

Estudos sobre extratos brutos, e frações obtidas por solventes de diferentes polaridades tem sido estudados sobre sua bioatividade, como é o caso do Protium spruceanum, com tudo, foca-se normalmente no estudo das frações hexânicas e hidrometanólicas[⁶]. Já relacionado a fração acetato de etila há estudos relacionadas a atividade antimicrobiana[⁸]. Já o extrato feito com acetato de etila foi eficiente na redução da eclodibilidade de ovos de Rhipicephalus microplus[⁹]. Contudo, não há relatos na literatura sobre o conteúdo de fenólicos totais, flavonoides e a capacidade antioxidante do extrato acetato de etila.

Diante do exposto, este trabalho teve como objetivo quantificar a composição de fenólicos e flavonoides, bem como a capacidade antioxidante e o perfil UV do extrato acetato de etila do Protium spruceanum.

Material e Métodos

Coleta e preparo do material

A coleta do material botânico foi realizada no mês de setembro de 2016 em uma vereda, localizada no município de Buenópolis/MG. Posteriormente, foi feita a exsicata da espécie, e depositada no herbário Montes Claros Minas Gerais (MCMG) sob voucher 5060.

Preparo do extrato

Para preparo do extrato, foram utilizadas amostras do caule, trituradas até a obtenção de um pó na proporção 10 g do pó (1:10) para 100 mL de acetato de etila. O extrato foi então armazenado em béquer por sete dias, realizando-se agitações esporádicas para completa mistura da amostra ao solvente. O solvente então foi evaporado, e o extrato seco foi armazenado em ambiente controlado e ao abrigo de luz.

Determinação do teor de fenólicos totais

Para a determinação de fenólicos totais foi utilizado o método Folin-Ciocalteu com modificações[¹⁰]. Para a realização do ensaio o extrato foi solubilizado em metanol 99%, em concentrações entre 200 e 400 ug/ml (250 μL) foi adicionado a uma alíquota de 2,75 mL do reagente de Folin-Cicalteu a 3%, após 5 minutos foram adicionados 250 μL de carbonato de sódio a 10%. A solução foi mantida ao abrigo de luz, por uma hora a 25ºC. A absorbância foi medida a 765 nm, com branco de metanol (250 μL) e Folin-Ciocalteu a 3% (2,75 mL), usando um espectrofotômetro UV-VIS (SHIMADZU-UV-VIS 2550). Todas as medições foram feitas em triplicata, e então os resultados foram calculados e plotados em um gráfico de (concentração/absorvância) para determinar a equação da reta e R². O ácido gálico (ácido 3,3,4-tri-hidroxibenzóico em concentrações entre 20-140 μL/mL) foi usado como padrão para derivar a curva de calibração. O conteúdo fenólico total foi expresso em mg equivalente de ácido gálico por 1 g do extrato.

Determinação do teor de flavonoides totais

O método do cloreto de alumínio foi utilizado para determinar o teor total de flavonoides[¹¹]. Para a realização do teste, o extrato, em concentrações entre 50 e 100%, foi utilizado (3000 μL) e adicionado a 200 μL de cloreto de alumínio a 5%. Esta solução foi mantida no escuro por 25 minutos a 25°C. A absorbância foi medida a 417 nm, com branco de metanol, usando um espectrofotômetro UV-VIS (SHIMADZU UV-VIS 2550). Todas as medições foram feitas em triplicata e, em seguida, os resultados foram calculados e plotados em um gráfico de (concentração/absorvência) para determinar a equação da reta e R2. Rutina (5-45 μg/mL) e quercetina (1,5-13,5 μg/mL) foram usadas como padrão para derivar a curva de calibração. O teor total de flavonoides foi expresso em mg equivalentes de rutina e quercetina por 1 g do extrato.

Capacidade antioxidante Ensaio DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil)

A atividade de eliminação do radical DPPH de amostras de mel foi determinada conforme descrito por Brand-Williams, et al.[¹²] com algumas modificações. Para a realização do teste, foi utilizado o extrato, em concentrações entre 20 e 45 ug/ml em metanol. Foi preparada uma solução estoque de DPPH de 40 μL/mL em metanol. A amostra foi então adicionada a 2000 μL de DPPH, agitada vigorosamente e mantida no escuro por 30 minutos a 25°C. Para obtenção da curva padrão do ácido gálico, foi preparada uma solução estoque a 10 μg/mL e utilizadas concentrações entre 2 e 5.5 μg/mL. A absorbância da solução foi medida a 517 nm, utilizando um espectrofotômetro (SHIMADZU UV-VIS 2550) contra um branco de metanol. Todas as medidas foram feitas em triplicata. Com os valores de absorbância, a porcentagem de atividade antioxidante foi calculada pela equação[¹³].

$\left\{\right(\text{AbsCont-AbsAmos}\left)/\text{AbsCont}\right)\}\times 100$ ,onde: AbsCont representa o valor de absorbância do controle, AbsAmos representa o valor de absorbância da amostra.

A partir dos resultados, foram construídos gráficos no Excel relacionando concentração e porcentagem de Atividade Antioxidante (%AA), e o EC₅₀, que consiste na capacidade da amostra de sequestrar 50% dos radicais livres DPPH, foi calculada através das equações de cada gráfico.

Análise UV

Para a análise do perfil UV, foi preparado uma solução estoque de 1 mg/mg em metanol, em seguida foram feitas diluições de 2 a 40 ppm de amostra por mL. Os padrões (ácido gálico, ácido tânico, rutina e quercetina) foram preparados entre 40 e 10 ppm em 5 ml de água destilada. Os espectros de varredura UV foram registrados na janela ultravioleta de 200 a 400 nm, com resolução de 2 nm, em um espectrômetro UV-Vis. As concentrações foram ajustadas para a mesma amplitude espectral entre a absorbância de 2.000 a 4.000. As concentrações ajustadas até a exclusão de ruídos na região entre 200 e 230 nm.

Para determinar o perfil UV foram preparadas soluções de padrões de 1 mg/mL e, posteriormente, solubilizadas em água, como pode ser observado na TABELA 1.

Resultados e Discussão

Os resultados das análises espectrofotométricas podem ser observados na TABELA 1.

Os teores de fenólicos totais relatados neste estudo para o extrato de acetato de etila de Protium spruceanum, foram considerados altos, 302.35 ± 0.97 mg por grama de extrato. Quando comparado a estudos com plantas do mesmo gênero como Protium tenuifolium, no qual o extrato da casca foi preparado com solução de etanol-água (1:1), com 112.6 mg AEG/g[¹⁴]. Teor relatado para o extrato metanólico Protium serratum foi de 55,53±14,63[¹⁵]. Nesse conjunto de dados é possível observar que o valor de fenólicos relatado neste estudo é superior a outros estudos que analisaram plantas do mesmo gênero. Além disso, o solvente utilizado para a produção dos extratos interfere diretamente no conteúdo de metabolitos. Solventes mais polares como etanol e metanol são mais cosmopolitas no processo de extração, já o acetato de etila, promove a extração de diversos grupos de metabólitos, especialmente pertencentes ao grupo de compostos fenólicos, devido a sua média polaridade. Estudos realizados com diferentes solventes corroboram com os presentes resultados[¹⁶].

A quantificação dos fenólicos totais foi feita a partir dos dados obtidos a partir da reta da curva padrão para ácido gálico, o cálculo de equivalência a ácido gálico para 1 g de amostra foi utilizado a equação obtida (y= 0.0066x – 0.049, R² =0.9927).

Já relacionado os flavonoides, foram encontrados os valores de 88.58 ± 0.08 mgEqR/g e 59.74 ± 0.05 mgEqQ/g, o que pode sugerir um maior teor de flavonoides do tipo glicosilados na amostra. Em estudo relacionado com a espécie P. serratum o teor de flavonoides foi de 106.33± 7.35 mgEqQ/g, teor maior que o encontrado no presente estudo[¹⁵]. Para o extrato da casca de P. tenuifolium foi relatado o teor de 5.3 mg catequina por grama de extrato[¹⁴], teor menor que o encontrado no estudo.

A quantificação dos flavonoides totais foi feita a partir dos dados obtidos a partir da reta da curva padrão para rutina e quercetina, o cálculo de equivalência para 1 g de amostra foi utilizada a equação obtida, rutina (y= 0.0283605x – 0.0283091, R² =0.99816) e quercetina (y= 0,0557672 x - 0,0402222, R² = 0.99914).

Em estudo realizado por Amparo, et al.[¹⁷] direcionado a identificação de substâncias por cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massas, foi possível a identificação de cinco substâncias fenólicas (procianidina, catequina, quercetina-3-O-glicuronida e quercetina). Em outro estudo do mesmo autor foi identificada a presença de rutina, afzelina e quercetrina todas pertencentes a classe dos flavonoides[¹⁸]. O que corrobora com os altos teores de fenólicos e flavonoides quantificados neste trabalho.

Já relacionada a capacidade antioxidante, obtidos com o ensaio DPPH, para o extrato acetato de etila com EC₅₀ foi de 23.10 ± 0.005 μg/mL, foi considerada alta. Contudo, resultados melhores para a mesma foram relatados em estudos anteriores[¹⁸] para o extrato hidrometanólico 70%, com 12,2 ± 1,5 µg/mL, extrato hidrometanólico 8.56 ± 0.52 µg/mL[¹⁹]. A atividade antioxidante é frequentemente relacionada a composição de fenólicos[²⁰]. o que vem de encontro aos dados quimiométricos já relatados neste trabalho. O valor inferior do EC₅₀ encontrado neste trabalho pode estar associado a baixa disponibilidade de elétrons ou grupos doadores, ou pode estar associado a presença de fenólicos glicosilados, que possuem uma capacidade antioxidante inferior a agliconas e fenólicos simples.

Para a determinação do EC50 para a atividade de eliminação de DPPH foram utilizadas as equações das retas de curva padrão de ácido gálico (y = 0.0066 x – 0.0486, R²= 0.9921) e para a amostra (y = 0,0133 x - 0,6798, R²= 0.993).

Os compostos fenólicos são substâncias de ocorrência natural em plantas, com enorme diversidade estruturais, ocorrendo como glicosídeos (ligados a um açúcar) ou agliconas (sem ligação com açúcar), em estruturas poliméricas ou monoméricas[²¹]. São substâncias com bioatividade, que promove a saúde humana, atuando diretamente em doenças não transmissíveis, como doenças cardiovasculares, diabetes, câncer, e dentre outros[²²]. Efeitos biológicos, como atividade antimicrobiana e anti-inflamatória também são relatadas[²³]. Além disso, os fenólicos têm papel de neutralizar os radicais livres[²⁴].

Análise UV

O espectro UV obtido do extrato de acetato de etila de P. spruceanum possui seus máximos de absorção em λ 279/217 nm (FIGURA 1). Máximos de absorção em 280-290 nm são atribuídos principalmente a ácidos fenólicos[²⁵]. As bandas características entre 250-280 estão relacionadas com flavonóis e 275-295 com isoflavonas e dihidroflavonóis[²⁶]. A leitura em λ 217 nm tem sido um fenômeno geral relacionado as transições π → π*em sistemas aromáticos, como o anel benzênico em compostos fenólicos. Além disso, substituições no anel benzênico são complexas, pois, pode haver deslocamentos batocromicos ou hipercromicos. Contudo, a região λ 217nm pode também estar associada a grupos alquila α,β ou β,β[²⁷]. Substâncias fenólicas com absorbância nessa região já foram relatados para ácido cafeico e ácido vanílico[²⁸]. Em comparação com os padrões analisados (ácido gálico, ácido tânico, quercetina e rutina) o extrato possui λmax em regiões dos padrões como o λ 279 nm, próximo ao encontrado no ácido tânico e λ 217/216 nm encontrado para ácido tânico e ácido gálico respetivamente, janela espectral atribuída a compostos aromáticos com substituintes como grupo hidroxila[²⁹].

Conclusão

A pesquisa sobre o extrato acetato de etila da espécie Protium spruceanum trouxe à luz resultados significativos sobre seu potencial fitoquímico e antioxidante. A análise fitoquímica revelou um alto teor de fenólicos totais (302,35 mg EAG/g) e flavonoides (88,58 mg EqR/g e 59,74 mg EqQ/g), indicando que essa espécie possui uma rica composição de compostos bioativos, potencialmente responsáveis por suas propriedades medicinais, como atividade analgésica e anti-inflamatória.

A capacidade antioxidante, evidenciada pelo valor de EC50 de 23,10 µg/mL, embora inferior a outros extratos estudados, ainda demonstra uma atividade considerável, reforçando a importância dos fenólicos na neutralização de radicais livres. As análises espectrofotométricas, incluindo a identificação de máximos de absorção em comprimentos de onda associados a ácidos fenólicos, confirmaram a presença de compostos bioativos relevantes, que podem ser explorados em aplicações na saúde.

Adicionalmente, a análise UV do extrato indicou picos de absorção em λ 279/217 nm, típicos de compostos fenólicos, como ácidos fenólicos e flavonoides. Esses resultados não apenas corroboram a riqueza química do extrato, mas também sugerem a complexidade estrutural dos compostos presentes, que podem contribuir para sua bioatividade. As bandas características observadas nas análises UV oferecem insights sobre a estrutura dos metabolitos, ampliando a compreensão de como esses compostos interagem biologicamente.

Em suma, Protium spruceanum se destaca como uma fonte promissora para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos e fitoterápicos. Futuros estudos são recomendados para aprofundar a investigação dos mecanismos de ação desses compostos, bem como sua aplicação na medicina tradicional e moderna, reforçando a relevância da biodiversidade vegetal na busca por tratamentos eficazes.

Agradecimentos

Laboratório de Bioinformática e Bioprodutos – LaBio e a Universidade Estadual de Montes Claros – Unimontes.

Referências

Datas de Publicação

Histórico