Ação dos extratos de Neoregelia compacta (Mez) L.B. Smith e Aechmea fasciata (Lindley) Baker sobre as formas imaturas de Aedes (Stegomyia) aegypti, Linnaeus, 1762

Resumo

Estudos discutem as bromélias como criadouros do Aedes aegypti L., vetor da dengue. Avaliou-se a toxidade de extratos brutos de Aechmea fasciata (Lindley) Baker (Bromeliaceae) e Neoregelia compacta (Mez) LB Smith (Bromeliaceae) em larvas de A. aegypti. Folhas de N. compacta trituradas com etanol e água destilada, hexano e acetato de etila, resultaram nos extratos hidroalcoólico, hexânico e de acetato de etila. Das flores e folhas de A. fasciata, maceradas em acetato de etila, obteve-se o extrato de acetato de etila. Os bioensaios foram realizados com aplicação desses extratos no meio de criação das larvas (L3) de A. aegypti. Neste estudo foram avaliadas a viabilidade larval e pupal, a emergência e a mortalidade. Os resultados dos bioensaios apontaram para a alta toxidade (DL50 = 39,4 μg/mL) de A. fasciata e (DL50 = 23 μg/mL) de N. compacta. Os dados sugerem estas bromeliáceas como fonte de bioprodutos ativos na busca de um fitoproduto larvicida no controle do mosquito vetor da dengue.

Palavras-chave:

atividade larvicida.

Bromeliaceae.

Aedes aegypti.

dengue.

Abstract

Several studies have discussed bromeliads as breeding grounds for Aedes aegypti L., a dengue vector. The toxicity of crude extracts of Aechmea fasciata (Lindley) Baker (Bromeliaceae) and Neoregelia compacta (Mez) LB Smith (Bromeliaceae) on A. aegypti larvae was evaluated in this study. Leaves of N. compacta were ground up with ethanol and distilled water, hexane and ethyl acetate to produce hydro alcoholic, hexane and ethyl acetate extracts. Flowers and leaves of A. fasciata were macerated in ethyl acetate to obtain an ethyl acetate extract. The bioassays were performed with application of these extracts to the breeding medium of L3 larvae of A. aegypti. In this study, larval and pupal viability, emergence and mortality were evaluated. The results from the bioassays indicated that these extracts were highly toxic: LD50=39.4μg/mL for A. fasciata and LD50= 23 μg/mL for N. compacta. The data suggest that, within the search for larvicidal phytoproducts, these bromeliads are sources of active bioproducts for dengue vector mosquito control.

Keywords:

larvicidal activity.

Brom aegypti.

dengue.

Introdução

As plantas são fontes ricas de substâncias farmacologicamente ativas, e algumas delas apresentam atividade larvicida e inseticida (Silva et al., 2003; Siddiqui et al., 2004) no que diz respeito ao controle de insetos nas culturas agrícolas (Morandi Filho et al., 2006) e na saúde pública (WHO, 2009).

A família Bromeliaceae, a que pertencem às espécies Noeregelia compacta (Mez) L.B. Smith e Achemea fasciata (Lindley) Baker, apresenta grande representatividade no Brasil (Manetti, Delaporte e Laverde Junior, 2009). As bromélias são importantes devido aos seus recipientes fitotelmatas, permanentes e ricos em micro e macro floras e faunas associadas, da qual podem participar formas imaturas de mosquitos da família Culicidae, incluindo-se o Aedes. Mas, poucos são os estudos referentes à química e farmacologia de N. compacta e A. fasciata. Na literatura observou-se que os principais compostos já isolados e identificados de bromélias são pertencentes às classes dos triterpenóides e flavonoides. Em menor número encontram-se os esteróis, diterpenos, ácidos cinâmicos, gliceróis, lignanas, entre outros (Williams, 1978; Manetti, Delaporte e Laverde Junior, 2009; Fabri e Costa, 2012). A ocorrência de flavonoides na família bromeliácea evidencia a importância química dos mesmos como possíveis agentes farmacológicos e possibilita considerá-los como potenciais quimiotaxonômicos. Manetti e colaboradores (2010), que identificaram flavonoides, taninos e saponinas, sugerem que a sua atividade citotóxica está relacionada provavelmente à presença de saponinas. Manetti, Delaporte e Laverde Junior (2009) relacionam a larga variedade de atividades fisiológicas aos diterpenos isolados de Bromeliacae.

Neoregelia compacta (Mez) L.B. Smith pertence à família Bromeliaceae, subfamília Bromelioideae, nativa do Brasil e endêmica nos estados do Rio de Janeiro e Espírito Santo (Silva e Gomes, 2003). Com poucos dados encontrados na literatura, entre os compostos derivados do metabolismo secundário do gênero Neoregelia há aqueles compartilhados com a família Bromeliaceae. Yano (2003) cita três esteroides e uma substância pura 3,4-dimetoxicinamato de 1'-glicerila dos extratos hexânicos de folhas de N. cruenta e P. flammea. Os extratos com diferentes preparações (hexânicos, metanólicos, aquosos) de folhas, rizomas, sementes e de frutos destas espécies mostraram atividades antineoplásica, antifúngica, antibacteriana e antioxidante.

O gênero Aechmea (Ruiz & Pav) é o maior e um dos mais complexos gêneros de Bromeliaceae (Forzza et al., 2012). Originária do Brasil, onde se encontram 60% de suas espécies, o gênero Aechmea reúne cerca de 240 espécies (Luther, 2008) endêmicas do Estado do Rio de Janeiro (Sousa e Wanderley, 2000).

Aedes aegypti L., vetor do vírus da dengue, é encontrado em áreas urbanas, e apresenta importância médica (Silva et al., 2004), por ser responsável por epidemias frequentes causadas pela migração dos quatro sorotipos nas Américas (WHO, 2009). A sua grande capacidade de adaptação a condições adversas, tais como períodos de quiescência de ovos em ambientes inóspitos (Barrera, 1996; Silva e Silva, 1999; Varejão et al., 2005; Serpa et al., 2006) e o crescimento normal em águas poluídas (Beserra et al., 2009; Beserra et al., 2010), faz com que o controle deste vetor seja muito difícil. O mosquito parece ter preferência por ambientes com riqueza de microrganismos e de matéria orgânica (Barrera, 1996), especialmente os encontrados em Bromeliaceae. A única forma de controle destes insetos ainda é aplicação de inseticidas e larvicidas.

Vários estudos têm chamado a atenção para os produtos naturais com atividade larvicida que poderiam ser úteis no controle de diversos vetores (Consoli et al., 1988; Park et al., 2002; Silva et al., 2003), incluindo A. aegypti (Cabral et al., 2009; Maleck et al., 2013).

Quando da epidemia de dengue no Rio de Janeiro em 2001/2002 foi levantada a possibilidade de bromélias domésticas serem criadouros de larvas de A. aegypti (Mocellin et al, 2009). Segundo Bermúdez-Monge e Barrios (2011) os efeitos químicos resultantes do metabolismo desses vegetais interferem na abundância e diversidade da fauna em seus reservatórios. A necessidade de seu estudo se torna primordial (Cunha et al., 2002) quanto à possibilidade de possuir e eliminar nos seus reservatórios substâncias com atividades larvicidas para A. aegypti e à desmistificação como seus prováveis criadouros.

Este estudo teve como objetivo avaliar a interferência sobre o desenvolvimento de formas imaturas de A. aegypti e a toxicidade dos extratos de A. fasciata e N. compacta sobre as mesmas, tendo em vista encontrar-se na literatura referências divergentes para o fato de as bromélias serem ou não criadouros de mosquitos.

Material e Métodos

Material vegetal

Endêmica do Estado do Rio de Janeiro (Sousa e Wanderley, 2000), A. fasciata apresenta folhagem rígida, com estrias verticais, rosuladas, em forma de roseta aberta até tubular; bainha em geral alargada, lâminas com margens serradas ou serrilhadas - espinhos nas bordas - e marmorizadas de verde com escamas cinza prateadas, principalmente quando jovem; a inflorescência, durável e rígida, é formada por brácteas cor-de-rosa vistosas a inconspícuas, com espinhos nas bordas e flores roxas delicadas, com dois apêndices petalinos internos; sépalas livres a conatas, em geral assimétricas e mucronadas; pétalas róseas e lilases; seis estames, inclusos na corola, livres ou os do segundo ciclo adnatos às pétalas; ovário ínfero; fruto baga; sementes sem apêndices conspícuos; rizoma conspícuo; escapo bem desenvolvido (Sousa e Wanderley, 2000).

Também nativa do Brasil, endêmica nos Estados do Rio de Janeiro e Espírito Santo, a N. compacta é um vegetal epífito caracterizando-se por ser acaule, rizomatosa, de roseta bem aberta, com até 0,40 m de diâmetro, com folhas largas, rijas e coriáceas, nas cores verde ou variegada. A inflorescência forma-se em uma depressão no centro da planta, pela modificação das folhas internas à roseta (brácteas) nas cores vermelho-viva, protegendo flores brancas e discretas e originando um receptáculo achatado para recolher água. As folhas que rodeiam as inflorescências são brilhantes e coloridas. Propaga-se por separação de rebentos ou por sementes (Silva e Gomes, 2003).

Dentre bromélias de origem brasileira, para este estudo foram escolhidas as espécies Aechmea fasciata (Lindley) Baker e Neoregelia compacta (Mez) L.B. Smith. Os representantes de bromélias usados neste estudo localizavam-se em área periurbana do Município de Miguel Pereira, RJ, região serrana do Estado do Rio de Janeiro, em altitude de 640m, com temperatura média de 24°C e índice pluviométrico de 1.750mm³ (PMMP, 2011). As bromélias encontravam-se dispostas no solo, entre as coordenadas 22°28'30.77"S e 43°29'35.51" O, e em galhos de árvores, entre as coordenadas 22°. 28' 30. 49"S e 43°29' 35. 23"O. Os espécimes utilizados foram classificados por Carlos Amaral e as suas exsicatas estão depositadas no Herbário da Universidade Severino Sombra, Vassouras, RJ, Brasil sob os números HUSSBRO-001(N. compacta) e HUSSBRO-002 (A. fasciata).

Extração

Folhas e caules de N. compacta e A. fasciata foram lavadas em água destilada e secas em temperatura ambiente. Após a secagem, o material vegetal foi fragmentado e triturado para a preparação dos extratos.

As folhas de N. compacta (38g) foram maceradas, separadamente, utilizando diferentes solventes com polaridade crescente: em hexano (Isofar) (400 mL), em acetato de etila (Quimex) (370 mL) e em etanol (Vetec) e água destilada (400 mL; 1:1), obtendo-se os extratos hexânico, de acetato de etila e hidroalcoólico.

As flores (23g) e folhas secas (60g) de A. fasciata foram maceradas em 230 mL e 600 mL acetato de etila. Todos os materiais foram preparados em frasco de vidro escuro, sob agitação ocasional de duas vezes por semana, durante 20 dias. Após a maceração, o material vegetal foi filtrado e evaporado em rotavapor a 40°C, armazenado em frasco de vidro escuro, e mantido em geladeira a 12°C e 25% de UR. Para a utilização nos bioensaios, os extratos hidroalcoólico e de acetato de etila foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO), devido a sua menor toxicidade perante aos demais solventes, e o extrato hexânico foi dissolvido em acetona, devido a sua polaridade.

Bioensaios

Os ovos de A. aegypti foram obtidos no Núcleo de Apoio e Pesquisa de Vetores-NapVE/Parceria DIRAC-IOC-VPAAPS/FIOCRUZ e mantidos no laboratório de Insetos Vetores/USS, Vassouras, RJ. Para os bioensaios, os ovos foram colocados em um recipiente (4,0 cm x 4,5cm) contendo água mineral. Após 1h foi adicionado a este meio, alimento de ração de peixes (Alcon Guppy) (0,3 mg/larva) (WHO, 1970; Cabral et al., 2009) para incubação dos ovos e desenvolvimento das larvas (Cabral et al., 2009; Narciso, 2009; Leite et al., 2012). Após a eclosão, as larvas de terceiro estádio (L3) foram separadas e colocadas (20 larvas por grupo) em recipientes de vidro, contendo água mineral (20 mL). Após 1h foi adicionado a este meio de criação larval, alimento de ração de peixe conforme citado acima, para a realização dos testes biológicos.

Para avaliação da atividade larvicida, os extratos de folhas e flores de N. compacta e A. fasciata foram aplicados ao meio de criação larval nas concentrações de 10, 100 e 200 μg mL^-1, e submetidos à investigação de atividade biológica sobre formas imaturas (L3) de A. aegypti.

Os bioensaios compreenderam grupos testes, grupo controle (controle sem solvente de diluição) e controle testemunho (com solvente de diluição). Todos os experimentos foram realizados em triplicata e três repetições. Os bioensaios foram mantidos em câmara climatizada a 27± 1°C, 70 ± 10% UR e foto período de 12h.

As observações foram realizadas durante 30 dias, e os resultados analisados quanto ao período de desenvolvimento, à viabilidade e à mortalidade, além de avaliação morfológica das larvas mortas através de microscopia óptica.

Análises Estatísticas

Os resultados foram tratados pela análise de variância F- ANOVA (Sokal e Rohlf, 1979), a significância estatística foi determinada pelo teste Tukey sendo considerado como significante P≤ 0,05 e o erro padrão calculado através da média dos experimentos, através do programa Graphpad Instat 3.05 (Motulsky, 1999) e BioEestat 5.0 (Ayres et al., 2007), e o teste χ² com nível de significância de P ≤ 0,01. Os desvios padrão foram calculados utilizando a média dos experimentos e aná lise de Trimmed Spearman-Karber para determinar a DL₅₀ (Hamilton, Russo e Thurson, 1977).

Resultados

Da extração vegetal foram obtidos 0,155g de extrato hexânico, 1,927 g de hidroalcoólico, 274 g de acetato de N. compacta e 179 mg de acetato de etila de A. fasciata.

O extrato hidroalcoólico de N. compacta estendeu a fase larval (L3-adulto) de A. aegypti em 3 dias em concentração de 10μg mL^-1(8-24) e diminuiu na concentração de 200 μg mL'¹ de L3-adulto (13-23) se comparado ao grupo controle (8-21) (TABELA 1A). O mesmo extrato de 200μg mL^-1 apresentou 4,7 ±2,6 de mortalidade para L4. Nas concentrações de 100 e 200μg mL^-1 a mortalidade de pupas foi de 5,0 ± 0,6 para a concentração de 100μg mL^-1 e 4,0 ± 1,5 para a de 200μg mL^-1 quando comparadas a não ocorrência de mortalidade de pupas no grupo controle (TABELA 1C).

A viabilidade de adultos foi de apenas de 5,0 ± 0,0 a 6.3± 4,0 (200 e 100μg mL^-1), em comparação a 18,3 ± 2,1 e 18,7 ± 2,3 de adultos dos grupos controles (TABELA 1B).

Na concentração de 100μg mL^-1 as larvas L3 duraram 4 dias, as L4 duraram 9 dias e as pupas sobreviventes duraram 11 dias, com mortalidade de 33% em 200μg mL^-1. As larvas L3 sobreviveram, as L4 duraram 10 dias com 25% de mortalidade e as pupas duraram 10 dias com 32% de mortalidade.

O extrato hexânico (200μg mL^-1) reduziu o período de desenvolvimento de larvas (L3) a adulto (15,0 ± 4,2) (P< 0,001) quando comparado aos controles (19,3 ± 3,7) e (20,0 ± 4,5) e aumentou o período de desenvolvimento larval na concentração de 100μg mL^-1 em 2 dias (2-11) em relação ao controle (2-9) (TABELA 2A). As concentrações de 100 (13,0 ± 3,5) (P=<0.001) e 200μg mL^-1(12,0 ± 4,4) (P=<0.001) aumentaram o período de desenvolvimento de pupa em dois dias se comparado ao grupo controle. O desenvolvimento de L3-adulto diminuiu em 2 dias na concentração de 10μg/mL^-1 (16,3 ± 3,7) (P=<0.01), 1 dia na concentração de 200μg mL^-1 (15,0 ± 4,2) (P=<0.001) e aumentou este período em 1 dia na concentração de 100μg mL^-1 (15,3 ± 4,1) (P=<0.001).

A mortalidade larval (L4) 5,3 ± 2,0; 6,7 ± 3,0 e 8,3 ±2,3 ocorrida em 10, 100 e 200μg mL^-1 respectivamente, de extrato hexânico, não foi registrada no grupo controle (TABELA 2C) e, reduziu significativamente (8,7 ± 1,5) (P=<0.001), (11,0 ± 2,0) (P=<0.001) e (9,0 ± 1,0) em 10,100 e 200μg mL^-1 a emergência em relação ao controle (19,0 ± 1,7) (TABELA 2B).

O extrato de acetato de etila (AcoEt) de N. compacta reduziu entre 1 a 2 dias o período de desenvolvimento de A. aegypti, na concentração de 10μg mL^-1 (9,0 ± 2,0) (P<0,001). Não houve desenvolvimento larval em 100 e 200μg mL^-1. O período de desenvolvimento L3-adulto (9,0 ± 2,0) (P=<0.001) e de pupas (7,2 ± 2,0) (P=<0.01) foi reduzido em 3 dias, na concentração de 10μg mL^-1 em relação ao controle 13,2 ± 1,7 e 10,6 ± 2, 3 respectivamente) (TABELA 3A). A viabilidade de adultos foi de 11,6 ± 3,0 em relação a 19,6 ± 0,6 no controle. A viabilidade de L3 a adulto (11,6 ± 3,0) (P=<0.001) foi reduzida, na concentração de 10μg mL^-1, em relação ao controle (19,6 ± 0,6). Devido à mortalidade não houve viabilidade em 100 e 200μg mL^-1 (TABELA 3B).

O extrato de AcoEt mostrou toxidade larval (L3) em 100 e 200μg mL^-1, em 4 dias após o tratamento, e uma dose letal (DL₅₀) = 23μg mL^-1. Na concentração de 10μg mL^-1 a mortalidade de pupas foi de 5,6 ± 2,8 em relação ao controle onde a mesma não ocorreu (TABELA 3C).

O estudo da atividade larvicida com o extrato de AcoEt de A. fasciata alterou o período de desenvolvimento das larvas, nas concentrações de 10 (2,3 ± 0,6) (P< 0,001) e 100μg mL^-1 (2,0 ± 0,0) (P<0,001) com redução de 5 dias; e, de L3-adulto (6,9 ± 1,4) (P<0,001) e (7,2 ± 1,6) (TABELA 4A).

Na concentração de 10μg mL^-1 de AcoEt, a viabilidade de pupa para adultos foi 11,0 ± 4,0 em relação ao grupo controle (19,7 ± 0,6). Na concentração de 100μg mL^-1, o extrato bruto de AcoEt resultou em mortalidade larval (L3), em 3 dias, e de 2,3 ± 4,0 (L4), perfazendo um total de 67% de larvas mortas num período de 10 dias. A mortalidade de pupas (3,6 ± 0,6) (P=<0.001) ocorreu em concentração de 10μg mL^-1 (TABELA 4C). A atividade larvicida foi obtida na concentração de 200μg mL^-1 com 100% de mortalidade larval em 3 dias após a aplicação do extrato de A. fasciata, e registrando uma DL₅₀ = 39,4μg mL^-1.

Discussão e Conclusão

Espécies da família Bromeliaceae vêm sendo estudadas quanto à identificação e isolamento e atividades farmacológicas de seus compostos orgânicos como triterpenos, esteroides, flavonoides, derivados de ácidos cinâmicos, gliceróis etc. (Manetti, Delaporte e Laverde Junior, 2009).

Em relação à atividade inseticida, citam-se os estudos com Bromelia antiacantha, bromélia terrestre nativa da Mata Atlântica, sobre o Hemiptera Oncopeltus fasciatus Dallas (1852) (Hemiptera: Lygaidae) (Santos et al. 2009). A toxidade dos extratos de B. antiacantha encontrada sobre o Hemiptera confirma o alto índice de mortalidade (55 a 100%), mostrados com os extratos de AcoEt (200μg mL^-1) de N. compacta e A. fasciata sobre as larvas de A. aegypti. Em contrapartida o extrato hexânico de N. compacta apresentou toxidade abaixo de 50% sobre as larvas de A. aegypti. Estes dados mostraram que a atividade larvicida foi obtida com o extrato de AcoEt tanto para N. compacta como para A. fasciata.

Estudos de Candido (2011) com os óleos vegetais de R. communis (mamona) e C. phyllacanthus (favela) sobre larvas L3 de A. aegypti demonstraram que os óleos vegetais daqueles vegetais apresentaram toxidade ao larval (L3) (90%); o estágio de pupa demonstrou ser susceptível aos extratos vegetais avaliados; que os tais extratos causaram mortalidade significativa dos mosquitos; que o aumento da exposição aos produtos implica na utilização de menores concentrações dos extratos vegetais para atividade pupicida de 100%; que óleos extraídos das sementes possuem maior potencialidade no controle de larvas e pupas; que concentrações letais CL₅₀ e CL₉₀ de C. phyllacanthus e R. communis alteraram o ciclo de vida do A. aegypti, reduzindo o índice de emergência de adultos tais como se obteve com extrato de AcoEt de N. compacta em concentração de 10μg mL^-1 (58%); que os extratos de mamona atuam negativamente em pelo menos algum estágio do ciclo de vida de A. aegypti, semelhante a extratos de 100μg mL^-1 e 200μg mL^-1 de N. compacta que foram letais a larvas do 4° estádio (L4).

Estudada a ação de extrato hexânico de N. compacta sobre larvas de terceiro instar (L3) de A. aegypti pode-se acrescentar que este, nas concentrações de 10, 100 e 200 μg mL^-1 não apresentaram toxidade sobre as larvas de 3° estádio (L3), as pupas e os adultos de A. aegypti, além da viabilidade de 100% entre L3-adultos no extrato dissolvido em acetona (testemunho). O extrato hidroalcoólico de N. compacta nas concentrações utilizadas, de 10, 100 e 200μg mL^-1, não apresentou toxidade significativa sobre a viabilidade e o desenvolvimento larval (L3 e L4) e pupal.

O extrato bruto de acetato de etila de N. compacta apresentou maior eficácia, nas concentrações de 100 e 200μg mL^-1sobre L3, L4 e pupas quando comparado aos extratos hidroalcoólico e hexânico da mesma espécie de bromélia.

Em extrato de acetato de etila de A. fasciata a eficácia da concentração 200μg mL^-1 expressou-se semelhante ao extrato de acetato de etila de N. compacta, eliminando as larvas L3 em menos de um dia e consequentemente impedindo seu desenvolvimento.

A toxidade do extrato de AcoEt de N. compacta (200μg mL^-1) sobre L4 foi de 100%. Tais resultados indicam o uso do extrato de N. compacta na concentração de 200μg mL^-1 no controle de formas imaturas de A. aegypti, também confirmando a ação de extratos de fumo (Nicotina tabacum), inseticida largamente estudado, que apresentou potencial larvicida, mas não como ovicida em A. aegypti como registrado por Quirino et al. (2009).

Consoli et al. (1988) utilizando extratos de vinte e nove espécies vegetais, verificaram suas influências na sobrevida de larvas de que A. fluviatilis (Lutz) (Diptera: Culicidae): que quando os extratos são diluídos em metanol e etanol não apresentam influência na sobrevida de larvas; os extratos de Anacardium occidentale, Agave americana, Allium sativum, Coriandrum sativum, Nerium oleander, Spatodea campanulata, Tibouchinas crobiculata e Vernonias alzmanni reduziram a sobrevida larvária significativamente quando em concentração de 100ppm; ainda demonstraram ação larvicida de A. sativum na concentração de 1 ppm e A. occidentale na concentração de 100 ppm., o que se pode confirmar na concentração de 100μg mL^-1de extrato de AcoEt de N. compacta e A. fasciata sobre as larvas L3.

O período de desenvolvimento larval pelo extrato de AcoEt de A. fasciata torna-se menor nas concentrações de 10μg mL^-1 e 100μg mL^-1(55% e 31,66%), respectivamente, e inexistente em 200μg mL^-1, o que significa que maiores concentrações aumentam o efeito tóxico sobre as larvas, se comparado ao desenvolvimento do grupo controle (98%) e ao grupo testemunho (93%), como demonstrado para outras espécies de bromélias estudadas por Consoli et al. (1988).

Os ensaios biológicos com os extratos brutos de A. fasciata e N. compacta, comparados ou não aos estudos encontrados sobre estas espécies de bromélias, sugerem a necessidade da purificação do extrato de acetato de etila na busca de uma fitoproduto natural com ação larvicida para A. aegypti. Este estudo é pioneiro sobre a atividade larvicida de extratos de N. compacta e A. fasciata sobre A. aegypti e consequentemente podendo agir como método alternativo sobre a população do principal mosquito vetor da dengue.

Agradecimentos

Os autores agradecem o suporte financeiro da Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ): a FUSVE/USS; a Dra. Nildimar Honorio Rocha (Núcleo de Apoio e Pesquisa de Vetores-NapVE/ Parceria DIRAC-IOC-VPAAPS/ FIOCRUZ) a parceria e os ovos de A. aegypti; a Dr³ Ana Paula de Almeida pelas correções e sugestões; e, a Msc. Michele Teixeira Serdeiro pelas sugestões e leitura do manuscrito.

Referências

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