Atividade antimicrobiana in vitro de extratos da casca do caule e da vagem de Libidibia ferrea L. frente a microrganismos da cavidade bucal

Resumo

No presente estudo foi avaliada a ação antimicrobiana in vitro do extrato da casca do caule e da vagem de jucá frente a microrganismos da cavidade bucal. Tratou-se de um estudo experimental laboratorial, no qual foi avaliada a atividade antimicrobiana dos extratos aquosos a 7,5% em diluições variando de 1:1 a 1:512, através da técnica de difusão em ágar. Foram utilizadas cepas padrão de Streptococcus salivarius (ATCC 7073); Streptococcus mutans (ATCC 25175); Streptococcus oralis (ATCC 10557); Lactobacillus casei (ATCC 7469) e a Candida albicans (INCQS 40040). A clorexidina 0,12% foi utilizada como controle positivo. Os resultados da difusão em ágar demonstraram que quando avaliado frente ao L. casei, o extrato da vagem mostrou-se mais efetivo, com CIM em 9,3 mg/ml compa rado à CIM da casca que foi 37,5 mg/ml. Quando o extrato da vagem foi testado frente aos S. oralis e S. mutans os valores de MIC foram iguais e o dobro, respectivamente, quando comparados com os valores obtidos com o extrato da casca do caule. Em relação a C. albicans, o valor de MIC para o extrato da vagem e da casca do caule foi 18,7 mg/ml. Enquanto que frente a S. salivarius o extrato da casca do caule teve valor de MIC 37,5 mg/ml e o extrato da vagem não apresentou atividade. Pode-se concluir que o extrato da casca do caule de jucá apresentou atividade antimicrobiana satisfatória frente aos patógenos da cavidade bucal e superior ao extrato da vagem.

Palavras-chave:

Libidibia ferrea L.

Biofilme.

Fitoterapia.

Abstract

In the present study was evaluated in vitro antimicrobial activity of the extract of the stem bark and fruit jucá against microorganisms of the oral cavity. This was an experimental laboratory study in which was evaluated the antimicrobial activity of aqueous extracts 7.5% in dilutions ranging from 1:1 to 1:512, using the technique of agar diffusion. Standard strains used were: Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus oralis (ATCC 10557), Lactobacillus casei (ATCC 7469), Candida albicans (INCQS 40040) and Streptococcus salivarius (ATCC 7073). Chlorhexidine 0.12 % was used as a positive control. The results of the agar diffusion showed that when assessed against L. casei, extract of the fruit was more effective, and with MICs 9.3 mg/mL compared to stem bark was 37.5 mg/mL. When the fruit extract were tested against S. oralis and S. mutans MIC values were the same and twice, respectively , when compared with values obtained with the extract of the stem bark . With respect to C. albicans, the MIC value for the extract of the fruit and stem bark was 18.7 mg/mL. While against S. salivarius extract of the stem bark had MIC value of 37.5 mg/mL and the extract of the fruit was inactive. It can be concluded that the extract of the stem bark of jucá showed satisfactory antimicrobial activity against pathogens of the oral cavity and superior to the extract of the fruit.

Key words:

Libidibia ferrea L.

Biofilm.

Phytotherapy.

Introdução

Na região Amazônica, existe uma grande biodiversidade de plantas medicinais utilizadas de maneira empírica, porém com indicações consolidadas por séculos de interação cultural. Dentre muitas plantas medicinais se destacam aquelas utilizadas como anti-inflamatório e antimicrobiano (Borrás, 2003).

Libidibia ferrea é uma planta utilizada na medicina popular e seus frutos possuem ação contra diabetes e anemia (Oliveira, 2008); além de atividade anti-cancerígena (Nakamura et al., 2002). Por outro lado, a casca do caule é utilizada para emagrecimento, como descongestionante em casos de enterocolite e diarreia, possível benefícios no sistema cardiovascular (Oliveira, 2008) e no tratamento de feridas cutâneas (Sampaio et al., 2009).

Desde que obtido adequadamente, o extrato vegetal reduzido a pó apresenta inúmeras vantagens frente à forma fluida, tais como, menor espaço necessário para o armazenamento do produto, melhor estabilidade, facilidade de manuseio e padronização dos princípios ativos presentes (Senna et al., 1997).

Através de estudo fitoquímico preliminar do extrato hidroalcoólico da casca e das folhas de jucá foi verificada a presença de flavonoides, saponinas, taninos, cumarinas, esteroides e compostos fenólicos (Silva, 2008). Taninos são os compostos majoritários do extrato e podem ser considerados os responsáveis pela atividade antidiabética (Souza et al., 2006). No caule, González, Barros e Bacchi (2004), também identificaram a presença de flavonoides, taninos, cumarinas, esteroides e derivados antracênicos.

Com relação à sua atividade, estudos comprovaram ação antimicrobiana sobre microrganismos do biofilme dental em modelo experimental com células planctônicas e multiespécie (Sampaio et al., 2009) e sobre cepas de Staphylococus aureus, Escherichia coli e Enterobacter gergoviae (Pereira et al., 2006).

Biofilme dental é o termo utilizado para descrever comunidades de microrganismos ligados à superfície do dente, tendo o Streptococcus mitis e o Streptococcus sanguis como bactérias pioneiras. A presença do Streptococcus mutans e do Streptococcus sobrinus, é mais prevalente nas etapas iniciais da cárie. O Lactobacillus casei é encontrado na evolução da cavitação (Buischi, 2000). Este biofilme é constituído de uma estrutura altamente organizada, na qual as espécies microbianas estão unidas umas às outras, formando conglomerados em uma matriz de polissacarídeos e, assim, criando um sistema altamente protetor para as espécies que nele residem (Walker, 2004).

Neste sentido, o presente estudo avaliou a atividade antimicrobiana dos extratos aquosos da vagem e da casca do caule de Libidibia ferrea L. a fim de obter uma matéria-prima para formulação de um produto de uso tópico para mucosa bucal.

Materiais e métodos

Material vegetal

A casca do caule e a vagem da espécie vegetal Libidibia ferrea L. foram coletadas na cidade de Manaus em locais e datas indicados na TABELA 1. A identificação botânica foi realizada no Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) recebendo o código de registro de número 228.022. Em seguida, as matérias-primas foram processadas na Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF/UFAM) de acordo com a metodologia descrita por (Melo et al. 2010).

Preparação do extrato

O fruto e a casca do caule da espécie Libidibia ferrea L. foram, separadamente, submetidos à secagem, seguindo-se a preparação do extrato. Tal escolha, quanto às partes da planta utilizadas no estudo, seguiu a orientação do modo de uso da medicina popular, e a fim de eliminar a dependência da sazonalidade do fruto, a casca do caule possibilitou uma nova opção de matéria-prima disponível durante todo o ano. Para a preparação do extrato foram utilizados os princípios de assepsia para que fosse preservada a qualidade do material.

O material vegetal, após coleta, foi colocado para secar a temperatura ambiente por 48 horas, a sombra, em lugar seco e arejado. Em seguida, todo o material foi submetido à secagem em estufa de ar circulante, à temperatura de 40 °C ± 2 °C, até estabilização da umidade residual. Após a secagem, os farmacógenos foram submetidos à moagem em moinho de facas, a fim de obter a matéria-prima vegetal (MPV).

O extrato da vagem foi obtido através da técnica de decocção, sob-refluxo, por um período de extração de 15 minutos em uma relação droga: solvente de 7,5% (m/V). O extrato da casca do caule, por sua vez, foi obtida por infusão a partir da MPV, por 15 minutos, numa relação droga: solvente de 7,5:100 (m/v). Ambos utilizaram água destilada como líquido extrator.

O material extraído foi resfriado e filtrado em um balão volumétrico de 1000 ml, completando-se o volume com água destilada. As soluções extrativas de jucá foram levadas para o aparelho Spray Dry para que fosse obtido o extrato seco por aspersão, visando reduzir a pó e manter a estabilidade.

Avaliação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do extrato da vagem e da casca de Libidibia ferrea L.

Microrganismos testes e preparação de inóculos

Os microrganismos utilizados para a determinação da CIM foram: Streptococcus salivarius (ATCC 7073); Streptococcus mutans (ATCC 25175); Streptococcus oralis (ATCC 10557); Lactobacillus casei (ATCC 7469) e a Candida albicans (INCQS 40040). As cepas bacterianas foram fornecidas pelo Laboratório de Microbiologia Bucal da Universidade Federal da Paraíba e INCQS / FIOCRUZ.

Para obtenção do inóculo os microrganismos foram reativados em caldo nutritivo de BHI (Brain Heart Infusion - DIFCO) em tubos de ensaios de 10x150mm, incubados a 37° C por 48 horas para Streptococcus mutans e os demais microrganismos por 24 horas, em aerofilia para o L. casei e em microaerofilia para os demais microrganismos. No caso da Candida albicans, foi reativado em caldo BHI e incubada a 37° C por 48 horas (Mattigati et al., 2012). Em condições assépticas foram retiradas alíquotas das bactérias e leveduras, inoculadas em 5 ml de caldo BHI, estéril, em tubo de ensaio de 10x150mm. As suspensões foram turbilhonadas em agitador de tubos (MARCONI, MA - 162) até se tornarem homogêneas. Os inóculos foram padronizados pela escala de McFarland (PROBAC) com turbidez compatível a 0,5, a fim de fornecer um padrão de 10⁸ UFC/ml (Sampaio et al., 2009).

Solução teste

Para a obtenção da solução teste 0,2 g de extrato em pó do fruto e da casca de jucá foram diluídos em 20 ml de água destilada. Foi levada ao agitador magnético (MARCONI - MA 085) a fim de obter soluções homogêneas.

Determinação da atividade antimicrobiana do extrato da vagem e da casca de Libidibia ferrea L. em meio sólido

A atividade antimicrobiana foi determinada, inicialmente, segundo metodologia proposta por Bauer e colaboradores (1966) modificados, através da difusão em meio sólido (FIGURA 1). Para tanto, as linhagens foram cultivadas em caldo nutritivo BHI (Brain Heart Infusion - DIFCO®), incubadas a 37°C por 24 horas.

Os meios para crescimento dos microrganismos foram preparados 24 horas antes do procedimento. Para melhor crescimento de S. mutans foram preparadas placas de Ágar Brain Heart Infusion (BHI - DIFCO®) suplementadas com 10% de sacarose; para C. albicans foram preparadas placas de Sabouraud Dextrose (DIFCO®) e placas de Agar Mueller Hinton (DIFCO®) para as demais bactérias. Após o controle de esterilidade, as placas foram inundadas com 10 ml solução salina inoculada com seus respectivos microrganismos do overnight, padronizados com a escala 0,5 de Mc Farland, em uma concentração de 10^-1 ml e no intervalo de 30 minutos de secagem em estufa, foram confeccionados orifícios padronizados de aproximadamente 6 mm de diâmetro.

Em cada placa foram confeccionados cinco orifícios que receberam numerações que variaram de 1 a 10, correspondendo a duas placas por ensaio de cada microrganismo. As numerações corresponderam ao número da diluição da substância teste em água destilada (1:1 até 1:512) como representada na TABELA 2, sendo o extrato puro a 75 mg/ml.

Após a colocação de 50µL dos extratos nos poços confeccionados, as placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37°C por 48 horas para Streptococcus mutans e Candida albicans e 24 horas para os demais microrganismos, a fim de permitir o crescimento microbiano e verificar a ação do extrato testado por meio da formação de halos de inibição. Cada ensaio foi realizado em duplicata frente a cada linhagem selecionada. O mesmo procedimento foi utilizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina de 0,12% (Periogard®).

A Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi a menor concentração da substância capaz de inibir completamente o crescimento bacteriano, ou seja, presença de halo maior ou igual de 12 mm (Bauer et al., 1969).

Resultados e discussões

O uso de fitoterápicos tornou-se crescente nos últimos tempos devido à adesão da população aos produtos de origem natural e à insatisfação com relação ao custo e à segurança da medicina convencional (Marques, 1992). Desta forma, novas pesquisas objetivando o desenvolvimento de formulações farmacêuticas a partir de matérias-primas vegetais que tenham eficácia e segurança comprovadas, têm sido desenvolvidas por vários pesquisadores (Gil, 2007).

A árvore adulta de jucá é descrita como vegetação pequena a mediana de até 10 metros de altura, muito predominante na vegetação da caatinga, sertão nordestino com abundância nos estados do Ceará e Bahia e introduzida na região amazônica a partir de imigrantes (Prance e Silva, 1975). Seus frutos são verdes enquanto imaturos e marrom após maturação, medindo em média 8,3 x 1,8 x 0,8 cm ele é de formato longo, levemente achatado e sinuoso com sutura ventral saliente, além de possuir base arredondada a curvada e ápice arredondado (Galdino, Mesquita e Kossmann, 2007).

A frutificação ocorre no final da estação seca e se prolonga por toda a estação chuvosa, possuindo flores amarelas e em cachos, o jucá apresenta alta produção de frutos em determinada época do ano (Galdino, Mesquita e Kossmann, 2007). A casca do caule, por sua vez, apresenta-se como matéria-prima disponível pra coleta durante todo o ano, eliminando uma fator crítico de sazonalidade inerente ao processo de frutificação da espécie Libidibia ferrea L.

O estudo utilizou o extrato aquoso da vagem e da casca do caule de jucá obtidos a partir do método de decocção e infusão, respectivamente. A metodologia diferente daquela descrita por Marreiro (2011), que utilizou a solução extratora de etanol (96°C) através da técnica de decocção e relata que a escolha do etanol foi pelo fato de não se tratar de um álcool tóxico (Carvalho, 2001). Difere também da metodologia descrita por Conde (2006), na qual a extração dos marcadores químicos foi feita através de percolação a temperatura ambiente e utilizando o metanol (80%v/v) como extrator. Porém ao comparar os líquidos de extração, (Spagolla et al. 2009) relataram que o metanol é mais eficiente na extração de compostos fenólicos.

Dessa forma, os extratos aquosos da Vagem e da casca do caule de jucá foram testados contra patógenos orais através do método de difusão em ágar. Os resultados com extratos da vagem, da casca do caule e clorexidina estão apresentados nas TABELAS 3, 4 e 5 e FIGURAS 2, 3 e 4, respectivamente. Quando avaliada a atividade frente ao L. casei, o extrato da vagem mostrou-se mais efetivo, com CIM em 9,3 mg/ml comparado à C|M da casca que foi 37,5 mg/ml (FIGURAS 2A e 3B). Quando o extrato da vagem foi testado frente aos S. oralis e S. mutans os valores de MIC foi igual e o dobro, respectivamente, quando comparados com os valores obtidos com o extrato da casca do caule. Em relação a C. albicans, o valor de MIC para o extrato da vagem e da casca do caule foi 18,7 mg/ml. Enquanto que frente a S. salivarius o extrato da casca do caule teve valor de MIC 37,5 mg/ml e o extrato da vagem não apresentou atividade (Tabela s 3 e 4).

Ao analisar os resultados do método de difusão em ágar, observa-se que houve sensibilidade dos microrganismos testados frente aos extratos da casca do caule e dos frutos de L ferrea, exceto em relação ao S. salivarius, o qual não apresentou halo de inibição superior a 12 mm com o extrato do fruto. O controle positivo de clorexidina a 0,12% apresentou atividade frente aos microrganismos testados (TABELA 5; FIGURA 4). Tal resultad o sugere a atividade antimicrobiana de jucá frente a diversas cepas de microrganismos.

Quanto à avaliação da atividade antibacteriana, Marreiro (2011) utilizaram o extrato hidroetanólico e um enxaguatório de Libidibia ferrea L. frente a cepas do meio oral, tais como Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus salivarius e Lactobacillos casei e avaliou sua ação antibacteriana através do método de micro diluição em microplacas para determinação da CIM (CLSI, 2002; Andrews et al., 2001; Sampaio et al., 2009). Seu estudo mostrou que o extrato de Libidibia ferrea L. a 0,6% apresentou atividade antibacteriana frente a S. mutans, S. oralis e L. casei nas concentrações de 4,375 µg/ml; 3,750 µg/ml; 4,375 pg/ml, respectivamente. Tanto o extrato quanto o enxaguatório foram eficazes frente a L. casei, S. oralis e S. mutans. Entretanto, frente a S. salivarius nem o extrato nem o enxaguatório de jucá apresentaram atividade antimicrobiana.

Tais resultados corroboram com os resultados do presente estudo, onde o extrato aquoso dos frutos de Libidibia ferrea L. não apresentou atividade frente a S. salivarius no método de difusão em ágar. Tal resultado direcionou o foco para o extrato aquoso da casca do caule, uma vez que o S. salivarius representa um dos microrganismos de colonização inicial em mucosa e tem participação na formação de biofilme (Marsh e Martins, 2005).

Por outro lado, Sampaio e colaboradores (2009) ao avaliarem a atividade antimicrobiana de extrato metanólico de frutos de L. ferrea contra patógenos orais, Candida albicans, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus oralis e Lactobacillus casei através do método de micro diluição para células planctônicas e em um modelo de biofilme in vitro, obtiveram atividade antimicrobiana. E frente a S. salivarius o valor de MIC encontrado foi 100 µg/ml.

De acordo com os resultados obtidos nos ensaios realizados, foi possível concluir que o extrato da casca do caule de jucá apresentou atividade antimicrobiana satisfatória frente aos patógenos da cavidade bucal e superior ao extrato da vagem quando testados através do método de difusão em ágar. Dessa forma, o extrato da casca do caule tornou-se o mais indicado para a formulação de uso tópico em mucosa oral.

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