Estudo fitoquímico de Plumbago auriculata Lam.

Resumo

A família Plumbaginaceae apresenta-se constituída por ervas, arbustos ou subarbustos de distribuição cosmopolita. Seus representantes apresentam produção metabólica caracterizada por naftoquinonas, flavonóides, terpenóides e esteróides, sendo os dois primeiros considerados marcadores quimiossistemáticos do grupo. O gênero Plumbago, tido como o mais representativo, compreende aproximadamente 10 espécies e tem sido alvo de estudos químicos e farmacológicos. Os estudos fitoquímicos de P. auriculata resultaram no isolamento de sitosterol, estigmasterol, 3-O-glicosilsitosterol, ácido palmítico, ácido plumbágico, epi-isoshinanolona, plumbagina, e uma mistura de dois flavonóides (luteolina e 5-metoxiluteolina). Apesar dessas substâncias já terem sido descritas na literatura, esse é o primeiro registro de luteolina e 5-metoxiluteolina em P. auriculata.

Unitermos:

Plumbago auriculata.

metabolismo secundário.

fitoquímica.

Abstract

The family Plumbaginaceae is formed by herbs, shrubs or subshrubs with cosmopolitan distribution. Its metabolic production is characterized by the presence of naphthoquinones, flavonoids, terpenoids and steroids, the formers being considered the chemosystematic markers for the group. The genus Plumbago, comprises approximately 10 species, and has already shown some chemical and pharmacological studies. Phytochemical studies of P. auriculata resulted on the isolation of sitosterol, stigmasterol; 3-O-glycosylsistosterol, palmitic acid; plumbagic acid, epi-isoshinanolone, plumbagin, and a mixture of two flavonoids (luteolin and 5-methoxyluteolin). Although these compounds have been previously reported in literature, this is the first report of the isolation of luteolin and 5-methoxyluteolin in P. auriculata.

Key words:

Plumbago auriculata.

secondary metabolism.

phytochemistry.

Introdução

As plantas representam, desde a antiguidade, um recurso para o ser humano, servindo para sua alimentação e para a cura de suas enfermidades. Atualmente inúmeras plantas são utilizadas na medicina popular e a elucidação de seus princípios ativos, pela ciência moderna, busca entender esse efeito terapêutico nas plantas (UGAZ, 1994). Poucas espécies vegetais são conhecidas dos pontos de vista químico e farmacológico e uma análise fitoquímica poderá proporcionar o conhecimento de novas drogas, talvez até mais potentes do que as usadas atualmente. O uso de produtos naturais como matéria-prima para a síntese de novas substâncias bioativas, especialmente fármacos, tem sido amplamente descrito ao longo do tempo.

A ordem Plumbaginales apresenta uma química caracterizada pela presença de naftoquinonas, flavonóides, terpenóides e esteróides de ocorrências comuns (PAIVA, 1999). Apresenta ainda uma grande produção tanífera, incluindo taninos condensados e hidrolisáveis. Vale ressaltar o isolamento de geraniina, um tanino elágico isolado de Limonium axillare, que apresenta atividade anti-tumoral (AHMED et al., 1999). Plumbago compreende cerca de 10 espécies, P. auriculata (sin. P. capensis), P. coerulea, P. europea, P. pearsonii (sin. P. suffruticosa), P. pulchella, P. rosea (sin. P. indica, P. coccinea), P. scandens, P. tristis (sin. P. vogeliaefolia), P. wissi e P. zeylanica (sin. P. viscosa). A espécie mais comum é P. zeylanica, conhecida também popularmente como “chita”. Morfologicamente, as plantas desse gênero apresentam geralmente pétalas brancas, com exceção para P. rosea e P. auriculata que se tornam distintas das demais espécies por apresentar pétalas vermelhas e azuis, respectivamente. (DINDA et al., 1997). Do ponto de vista biológico, espécies de Plumbago são descritas na literatura como antiparasitário (CHANBACAB; PEÑA-RODRIGUEZ, 2001), anti-tumoral (DEVI et al., 1994), bactericida (AHMAD et al., 1998; PAIVA, 2003), fungicida (MAHONEY et al., 2000; PAIVA et al., 2003), inseticida (BANERJEE et al., 2001; GHOSH et al., 1994; RAO et al., 1996), antiinflamatório (OYEDAPO, 1996), atividade filaricida (MATHEW et al., 2002) entre outros. O presente estudo visa incrementar o conhecimento sobre a química da família através do isolamento de substâncias a partir de Plumbago auriculata.

Materiais e Métodos

Equipamentos: As análises cromatográficas com fase gasosa, acopladas à espectrometria de massas foram realizadas utilizando-se um cromatográfo Hewlett-Packard 6890, acoplado a um espectrômetro de massas HP 5972 munido de um banco de dados (Wiley 275.1). Foi usada uma coluna capilar do tipo HP-5MS (30 m x 250 µm x 0,25 µm de espessura do filme). O gás de arraste foi hélio (1 mL/min) e as separações realizadas com injetor a 250 °C, detector a 280 °C, e a seguinte programação de temperatura: 70 - 290 °C, com taxa de aquecimento de 2 °C/min. Os parâmetros da operação de EM foram 70 eV, fonte iônica 250 °C, impacto de elétrons. A cromatografia em coluna de sílica fase reversa RP-18 (40 - 63 µm) sob média pressão foi realizada em equipamento Büchi, com bomba modelo 688 e formador de gradiente modelo 687, além de detector de UV. Foi usada uma coluna Büchi 17981, com 30 cm de altura e 3 cm de diâmetro e gradiente metanol: água. A cromatografia contra-corrente foi realizada em CCC Pharma-Tech modelo 1000, acoplado a um coletor de frações Advantec SF-2120. Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN ¹H) e carbono (RMN ¹³C), além de DEPT, COSY e HETCOR, foram registrados em espectrômetro Brüker modelo AC200, em freqüências de 200 e 25,5 MHz, respectivamente. Foram utilizados solventes deuterados e TMS como padrão interno. Os espectros de 400 MHz foram realizados em espectrômetro Brüker DRX. Os espectros na faixa do ultravioleta foram realizados em equipamento Shimadzu modelo UV - 1601 PC. Os pontos de fusão das substâncias isoladas foram obtidos em aparelho MQAPF-301 da Microquímica Ind. e Com. Ltda. Para a obtenção dos extratos, o solvente foi eliminado em evaporador rotatório Büchi R-114, equipado com controlador de vácuo Büchi B-720 e um banho refrigerante Büchi B-480.

Solventes e reagentes: Os fracionamentos cromatográficos foram realizados em colunas com gel de sílica Merck e Sephadex LH-20. Para cromatografia em camada fina foram utilizadas cromatoplacas de gel de sílica 60 F254+356 Merck e RP-18 Merck. Os reveladores para cromatografia em camada fina utilizados foram Godin (vanilina 1% em etanol e ácido perclórico 3% em água, na proporção 1:1; ácido sulfúrico 10% em etanol) (GODIN, 1954), solução de sulfato cérico a 2% em H²SO⁴, seguidos de aquecimento, e reagente NP/PEG (difenilboriloxietilamina/polietilenoglicol) (WAGNER, 1984).

Material botânico: Indivíduos inteiros de P. auriculata foram coletados no campus da Fundação Oswaldo Cruz e a exsicata encontra-se depositada no Herbário do Museu Nacional^®, Rio de Janeiro, RJ, sob número de registro 193592.

Preparação dos Extratos: As folhas, caules e raízes foram previamente secas em estufa a 40 °C, e posteriormente reduzidas a pequenos fragmentos. Após o processamento preliminar, caules e folhas foram submetidos, separadamente, à extração por maceração estática com hexano e metanol em seqüência. As raízes foram extraídas em aparelho Soxhlet por 30 horas com CHCl³ (SANKARAM et al., 1976).

Fracionamento dos Extratos

Extrato hexânico bruto das folhas: O extrato hexânico bruto das folhas de P. auriculata foi cromatografado em coluna com gel de sílica eluída com hexano, acetato de etila e metanol em gradiente de polaridades crescente. A fração 1-8 foi identificada como uma mistura de hidrocarbonetos de C²³ a C³³. Da fração eluída com hexano/acetato de etila 10% obteve-se um sólido branco, cristalizado em forma de agulhas, identificado como a mistura dos esteróides 1 e 2.

Mistura: PF: 123-125 ºC. CG/EM (m/z%): Substância (1): 412 [M]⁺ (1,2); 300 (1,2); 271 (3,7); 255 (4,3); 299 (1,8); 213 (4,3). Substância (2): 414 [M]⁺ (1,8); 329 (2,5); 303 (2,5); 255 (3,0); 231 (1,8); 229 (1,2); 213 (5,5). RMN ¹H (200 MHz, CDCl³) δ ppm: 0,60-2,5 (s, d) sinais de grupos metílicos, metilênicos e metínicos dos esqueletos esteroídicos; 3,5 e 3,65 (m) sinais de hidrogênios carbinólicos; 4,9-5,2 (m) H-22 e H-23 de (1); 5,35 (d, J 5,2 Hz) sinais dos H-6 olefínicos dos dois esteróides.RMN ¹³C (25,5 MHz, CDCl³) δ ppm: (1): 37,29 (C1); 31,71 (C2); 71,84 (C3); 42,36 (C4); 140,8 (C5); 121,71 (C6); 31,96 (C7); 31,96 (C8); 50,20 (C9); 36,54 (C10); 21,11 (C11); 39,84 (C12); 42,36 (C13); 56,82 (C14); 24,31 (C15); 28,24 (C16); 56,12 (C17); 11,87 (C18); 19,07 (C19); 36,18 (C20); 18,81 (C21); 138,0 (C22); 129,0 (C23); 45,90 (C24); 29,24 (C25); 19,80 (C26); 19,39 (C27); 23,13 (C28); 11,99 (C29); (2): 34,02 (C22); 26,21 (C23).

A fração eluída em hexano/acetato de etila 15%, após recromatografia forneceu a Substância (3): C¹⁶H³²O². PF: 53,6 °C; EM: m/z 256[M]⁺ (11), 213 (8,6); 185 (6,1); 171 (6,1); 157 (7,4); 129 (24,7); 115 (11); 97 (13,5); 83 (21); 73 (100).

Extrato clorofórmico bruto das raízes: O fracionamento desse extrato foi realizado por cromatografia contra-corrente, utilizando-se o sistema de solvente hexano:acetato de etila:metanol:água (40:10:10:2 v/v), com fluxo de 2 mL/min e rotação de 1000 rpm. O procedimento de separação foi iniciado utilizando a fase superior como fase móvel. A reunião das frações 1-5 forneceu um sólido branco identificado como a substância (2) e as frações 6-17, após purificação, forneceu a substância (3). Da fração 23, obteve-se a substância (4), como um sólido amorfo de coloração amarela; e as frações 29-36, forneceram a substância (5), com cristalização em forma de agulhas de coloração amarela. Com a inversão do modo de eluição, utilizando a fase inferior como fase móvel, foram isoladas as substâncias (6) (cristais na forma de agulhas) e (7) (sólido amorfo de coloração branca).

Substância (4):

C₁₁H₁₂O₃. RMN ¹³C (25,5 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 204,1 (C4); 162,0 (C5); 146,4 (C9); 136,8 (C7); 119,1 (C6); 117,8 (C8); 115,3 (C10); 73,0 (C1); 43,3 (C3); 37,3 (C2); 17,7 (C11). CG/EM m/z192 [M]⁺ (35), 177 (6,2), 175 (5), 163 (5), 159, 121 (100).

Substância (5): C¹¹H⁸O³, PF. 74 °C, UV λ^máx (CHCl³) 253 e 424 nm. RMN ¹³C (25,5 MHz, CDCl³) δ (ppm): 190.2 (C4), 184.6 (C1), 161.2 (C5), 149.5 (C2), 136.0 (C7), 135.4 (C3), 132.1 (C9), 124.0 (C6), 119.1 (C8), 115.1 (C10), 16.3 (C11). RMN ¹H (200 MHz, CDCl³) δ (ppm): 6.76 (q, H3), 7.20 (dd, H6), 7.55 (d, H7), 2.17 (3H, s, H11). CG/EM m/z 188 [M]⁺ (100), 173 [M - CH3] (34), 160 (32), 131 (70), 120 (34), 92 (52), 77 (26), 63 (54), 51 (19).

Substância (6): C¹¹H¹²O⁵, PF. 91.8 °C. EM: m/z 224 [M]⁺ (9), 206 [M - H²O]⁺ (10), 178 (12), 163 (7), 137 (100), 109 (6), 81 (15). RMN ¹H (400 MHz, CDCl³) δ (ppm): 3.0 (1H, dd, J 17.0, 9.0 Hz, H2a), 2.51 (1H, dd, J 17.0, 5.0 Hz, H2b), 3.93 (1H, m, H3), 1.29 (3H, d, J 7.0 Hz, H5), 7.35 (1H, d, J 8.0 Hz, H11), 6.83 (1H, dd, J 8.0 Hz, H10) e 7.13 (1H, d, J 8.0 Hz, H9).

Substância (7): C³⁵H⁶⁰O⁶, PF. 277.6-278 °C. RMN ¹H (200 MHz, PyD⁵) δ (ppm): 0,6-1,1 (sinais referentes aos grupos metila), 3,5-4,7 (sinais referentes aos hidrogênios carbinólicos), 5.03 (d, J 8,6 Hz, H1 Glu), 5.8 (s, H6). RMN ¹³C (50 MHz, PyD⁵) δ (ppm): 141,4 (C5), 122,3 (C6), 103,0 (C1’ Glu), 78,7 (C3), 78,2 (C5’ Glu), 75,7 (C2’ Glu), 72,2 (C4’ Glu), 63,3 (C6’ Glu), 57,3 (C14), 56,7 (C17), 50,8 (C9), 46,5 (C24), 42,9 (C13), 37,4 (C1), 37,9 (C10), 34,7 (C22), 32,5 (C8), 32,5 (C7), 30,7 (C2), 30,0 (C25), 28,9 (C16), 27,0 (C23), 24,9 (C15), 23,8 (C28), 21,7 (C11), 20,3 (C27), 19,8 (C19), 19,7 (C26), 19,4 (C21), 12,6 (C29), 12,3 (C18).

Extrato metanólico bruto do caule: Do extrato metanólico do caule de P. auriculata foi suspenso em água, e submetido a uma partição líquido-líquido com hexano, diclorometano, acetato de etila e butanol. O extrato resultante da partição em acetato de etila foi submetido à cromatografia em coluna com Sephadex LH-20, utilizando como eluente CHCl³:MeOH (1:1, v/v) em modo isocrático. A fração 18-21 foi dissolvida em água e submetida à cromatografia líquida de média pressão (MPLC) com celulose, utilizando como eluentes metanol e água em diferentes polaridades com fluxo de 7ml/min. A fração 39, eluída com MeOH 90%, apresentou uma mistura de coloração amarela quando revelada com NP/PEG, sugerindo características flavonoídicas, sendo posteriormente identificadas como as substâncias (8) e (9).

Substância (8): C¹⁵H¹²O⁶. RMN ¹H (400 MHz, MeOD) δ (ppm): 7,33 (1H, d, J 2,2 Hz, H2’); 7,36 (1H, dd, J 8,5 e 2,2 Hz; H6’); 6,86 (1H, d, J 8,5 Hz, H5’); 6,39 (1H, d, J 2,2, H8); 6,49 (1H, s, H3); 6,15 (1H, d, J 2,2 Hz, H6).

Substância (9): C¹⁶H¹⁴O⁶. RMN ¹H (400 MHz, MeOD) δ (ppm): 7,33 (1H, d, J 2,2 Hz, H2’); 7,36 (1H, dd, J 8,5 e 2,2 Hz; H6’); 6,86 (1H, d, J 8,5 Hz, H5’); 6,58 (1H, d, J 2,2, H6); 6,53 (1H, s, H3); 6,30 (1H, d, J 2,2 Hz, H8), 3,89 (s, OMe-7).

Resultados e Discussão

Análise dos rendimentos extrativos obtidos para P. auriculata demonstrou superioridade para os extratos obtidos a partir das folhas, como pode ser observado na Tabela 1. O extrato hexânico bruto dos caules de P. auriculata não foi fracionado devido ao baixo rendimento extrativo. O fracionamento cromatográfico do extrato hexânico das folhas de P. auriculata resultou em uma mistura de hidrocarbonetos de C²³ a C³³, sendo C²⁹ o mais representativo, com 25% de área relativa o cromatograma, tempo de retenção de 22,7 min e peso molecular 408 u.m.a. As demais frações, após recristalização forneceram a mistura dos esteróides estigmasterol (1) e sitosterol (2), que tiveram seus dados espectrais confirmados pela literatura (CASTILHO, 2001; CHAURASIA; WITCHL, 1987) e a substância (3) que, após a análise de CG/EM, foi identificada como o ácido palmítico, após comparação com o banco de dados do equipamento. O extrato clorofórmico das raízes foi cromatografado através de cromatografia líquido-líquido contra-corrente, utilizando o sistema de solvente hexano: acetato de etila: metanol: água (40:10:10:2). A partir deste fracionamento, também foram isolados: sitosterol (2), ácido palmítico (3), além de epi-isoshinanolona (4), plumbagina (5); ácido plumbágico (6) e 3-O-glicosilsitosterol (7). Os dados referentes a esse isolamento encontram-se em Paiva et al. (2005).

O extrato metanólico do caule foi submetido à partição líquido-líquido, e a fração em acetato de etila foi cromatografada em coluna com Sephadex. As frações 18-21 foram reunidas e submetidas à cromatografia líquida de média pressão com celulose. A fração eluída com MeOH 90%, forneceu um sólido amorfo de cor amarelada. Análise através de RMN ¹H indicou sinais característicos da presença de duas moléculas flavonoídicas. Foram observados dois singletos em δ 6,49 e 6,53, relativos ao H3, o que sugere uma mistura de duas flavonas. O padrão de substituição do anel A nas posições 5 e 7 para as duas flavonas da mistura apresenta dois conjuntos de dubletos em δ 6,15 e 6,39 e em δ 6,30 e 6,58. Essas correlações foram estabelecidas através do espectro de COSY. A presença de um singleto em δ 3,89 refere-se a um grupo metoxila em uma das flavonas, o que favorece o deslocamento dos dubletos em δ 6,30 e 6,58 para campo mais baixo. Os sinais observados na faixa de δ 6,84 - 6,87 referem-se ao hidrogênio da posição 5’, enquanto os sinais entre 7,32 - 7,37 correspondem aos hidrogênios das posições 6’ e 2’, do anel B. As duas substâncias foram portanto identificadas como a luteolina (8) e a 5-metoxiluteolina (9), sendo descritas pela primeira vez para a espécie Plumbago auriculata. Os dados espectrais dos dois flavonóides foram confirmados com os descritos na literatura (HARBORNE, 1994). As substâncias isoladas a partir de extratos de P. auriculata, descritas no presente trabalho, estão representadas na Figura 1.

O presente estudo fitoquímico revelou substâncias ainda não descritas na literatura para P. auriculata, como foi o caso dos flavonóides luteolina e 5-metoxiluteolina. Esses resultados corroboram estudos anteriores de quimiossistemática e reforçam a representatividade na produção de flavonóides e naftoquinonas por espécies de Plumbaginaceae.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Central Analítica de Far-Manguinhos, ao Dr. Alvicler Magalhães e ao CNPq.

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