Micropropagação e conservação de Lychnophora ericoides Mart.: uma espécie medicinal do cerrado brasileiro

Resumo

Gema apical e embriões de Lychnophora ericoides foram cultivados in vitro em meio de cultura suplementado com diferentes concentrações de benzilaminopurina (BAP) e ácido indolacético (AIA). A concentração de 1.11 M de BAP foi a mais adequada ao desenvolvimento das plântulas (1,02 cm) e a concentração de 4,93 M de ácido 3-butil-indolacético (ABI) promoveu melhor enraizamento. Análises de extratos de plântulas micropropagadas e cultivadas a partir de sementes foram realizadas por Cromatografia Líquida de Alta Performance (CLAE), e o perfil químico de ambos extratos mostraram-se semelhantes quanto à presença de lactonas sesquiterpênicas. A conservação de plântulas de L. ericoides em banco de germoplasma in vitro foi realizada em meio de cultura meio de Murashige and Skoog MS/2, suplementado com 2% de sacarose e 4% de sorbitol (p/v). As plântulas foram mantidas nesse meio por 10 meses com 96,6 % de sobrevivência.

Unitermos:

Cultura de células.

Arnica.

Lactones sesquiterpênicas.

Metabólitos secundários.

Abstract

Axillary buds excised from Lychnophora ericoides in vitro plantlets were inoculated onto MS medium supplemented with different concentrations of benzylaminopurine (BAP) and indolacetic acid (IAA). Developed plantlets were transferred to MS medium supplemented with indol-3-butyl-acetic acid (IBA) or naphtalenacetic acid (NAA) for rooting. BAP at a concentration of 1,11 M promoted plant growth (1,02 cm). Murashige and Skoog halfstrenght medium (MS/2) medium supplemented with indol-3-butyl-acétic acid (IBA, 4,93 M) was the most suitable for rooting. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) analysis of the in vitro and ex vitro plant extracts showed the presence of sesquiterpene lactones. For germplasm maintenance, cultures of L. ericoides were stored on MS/2 with 3% (w/v) sucrose plus 4% (w/v) sorbitol and maintained viable at a low growth rate with no subcultures during 10 months.

Key words:

Cell culture.

Arnica.

Sesquiterpene lactones.

Secondary metabolites.

Introdução

O gênero Lychnophora (Asteraceae) tem sido bastante estudado por conter biomoléculas com atividade antitumoral (PETIT et al., 1990), tripanocida (OLIVEIRA et al., 1996; GRAEL et al., 2000) e antimicrobiana (MIGUEL et al., 1996). Estudos fitoquímicos com L. ericoides e L. pseudovillosissima levaram ao isolamento de lactonas sesquiterpênicas, triterpenos e flavonas (BORELLA et al., 1998). Duas entre as várias substâncias isoladas, centraterina e goyazensolida, mostraram potente ação antiinflamatória in vitro pela inibição seletiva de fator de transcrição NF-kB (RUNGELER et al., 1999).

A Lychnophora ericoides é conhecida no Brasil como arnica da serra e a alcoolatura das folhas é indicado como analgésico e antiinflamatório. Devido sua eficácia terapêutica, desde o século XVIII L. ericoides tem sido coletada indiscriminadamente e o número de indivíduos e populações desta espécie no cerrado brasileiro está drasticamente reduzido (BASTOS et.al., 1987). De acordo com a Sociedade Brasileira de Botânica (SBB, 1992) e o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (BRASIL, 1992), a erosão genética causada pela coleta indiscriminada de plantas e a falta de metodologia de propagação apropriada vêm levando a L. ericoides à ex-tinção. A arnica da serra é um arbusto que cresce no cerrado, compondo especificamente a florística de campo rupestre. O bioma cerrado é considerado um dos reservatórios de plantas e de vida animal mais ricos e ameaçados do planeta e foi classificado como hotspot (MITTERMEIER et al., 2000). Diante disto, estudos sobre a biologia reprodutiva de espécies do cerrado incluindo propagação assex-uada para conservação merecem grande atenção. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo otimizado para a propagação in vitro e conservação do germoplasma de L. ericoides. Este é o primeiro relato sobre cultura de tecidos de L. ericoides para o desenvolvimento de tecnologia in vitro, visando à propagação e conservação dessa espécie.

Materiais e Métodos

Assepsia. As sementes (diásporos) e gemas apicais da espécie L. ericoides foram coletadas em três diferentes regiões do estado de Minas Gerais, próx-imas às cidades de Ibiraci (20° 32 ‘ 08” S; 47° 08 ‘ 14” W; altitude 1061 m), Delfinópolis (20° 20 ‘ 33” S; 46º 47 ‘ 38” W; altitude 839 m) e Furnas (20° 38’ 16” S; 46º 19’ 40” W; altitude 873m), (voucher n°s HPMU 054, 018 e 023, respectivamente). O material vegetal lavado em água corrente por 12 h, foi imerso em solução de Benomyl 1% (w/v) por 24 h sob agitação, mergulhado em solução álcool/água 70% (v/v) por 1 min, e depois em solução de hipoclorito de cálcio 0.5% (w/v) por 30 min. Após assepsia as sementes e gemas apicais foram inoculadas em placas de Petri contendo meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), sem reguladores de crescimento. Os tratamentos foram repetidos três vezes com 10 replicatas. O mesmo procedimento de desinfecção descrito acima foi repetido para diásporos coletados no estado de Minas Gerais na região de Sacramento (19° 54’ 27” S; 47° 22’ 35” W; altitude 920 m), São João Batista da Glória (20° 31’ 58” S; 46° 24’ 11” W; altitude 1277m), e Arax-á (19° 42’ 28” S; 46º 51’ 06” W; altitude 1363 m) (voucher n°s HPMU 88, 022 e 97, respectivamente). Após a desinfecção, os diásporos foram abertos com bisturi, dentro da câmara de flux-o laminar e os embriões removidos foram inoculados em meio de cultura MS/2 sem reguladores de crescimento, suplementado com 0.5% de PVP (polivinil-2-pirrolidona). Após 20 dias, foram verificadas as porcentagens de contaminação e germinação dos embriões. Os tratamentos foram repetidos três vezes com 100 replicatas.

Multiplicação. As plântulas propagadas a partir das sementes coletadas na região de Ibiraci e as germinadas in vitro colecionadas foram cultivadas durante três meses em meio MS suplementado com 10,14 μM de ácido naftalenoacético (ANA) e 17,76 μM 6-benzilaminopurina (BAP). Gemas ax-ilares ex-cisadas de plântulas in vitro foram inoculadas em meio MS suplementado com diferentes concentrações de BAP ou com a combinação de BAP e ácido 3-indolacético (AIA) (Tabela 2). Após a seleção do meio de cultura mais apropriado para multiplicação, plântulas propagadas a partir das sementes coletadas na região de Delfinópolis e Furnas foram cultivadas em meio MS suplementado com 1,11 μM de BAP e avaliadas para número e altura de brotos. Os ex-perimentos foram conduzidos em frascos de vidro (8.5 cm altura x- 5.5 cm i.d.) contendo 30 mL de meio MS suplementado com 3% (w/v) sacarose, solidificado com 0.2% (w/v) Phytagel^®, com o pH ajustado a 6.0, autoclavado 20 min a 105 kPa. Os frascos de cultura foram fechados com tampas de polipropileno (Bellco), selados com filme plástico (Parafilm Rolopac), e mantidos à 25 ± 2 ºC e 55-60% umidade relativa, sob fotoperíodo de 16-h dia (40 μMol m^-2 s^-1, fornecido por 2 lâmpadas fluorescentes branca-frias GE, 85 W). Todos os ex-perimentos desenvolvidos sob condição in vitro foram realizados com 3 repetições e 10 replicatas por tratamento.

Enraizamento. Para promover a formação de raízes, as plântulas, micropropagadas a partir de sementes coletadas nas três diferentes regiões, com dois pares de folhas, foram inoculadas em meio MS suplementado com diferentes concentrações de ácido indol-3-butírico (AIB) ou ANA (Tabela 3).

Conservação de Germoplasma. Para o estabelecimento do banco de germoplasma in vitro, as plântulas de arnica foram transferidas para o meio MS/2 suplementado com 2% de sacarose mais adição de 3% de manitol, 4% de sorbitol e 8,3 μM de pantotenato de cálcio (Tabela 4). As culturas foram incubadas por 10 meses a 18°C, sob fotoperíodo de 12h, fornecido por lâmpadas fluorescentes branca-fria GE com baix-a luminosidade (23 μMol m^-2 s^-1). As plântulas foram então avaliadas quanto ao número de brotos por gemas, crescimento e sobrevivência das plântulas.

Aclimatação. Plântulas enraizadas em meio MS suplementados com aux-inas e plântulas sem sistemas radiculares, cultivadas em meio MS suplementado com BAP, medindo aprox-imadamente 4 cm, foram transplantadas diretamente em vasos esterilizados (5 L), contendo uma mistura de solo/areia (1:1). Durante a primeira semana, as plântulas foram mantidas em estufa, irrigadas três vezes ao dia, e borrifadas diariamente com uma solução 0,005% de ampicilina (w/v). Após o período de 3 meses as plantas foram avaliadas quanto à proliferação de brotos e raízes.

Análise por CLAE. As folhas (20 mg p.s.) de plântulas micropropagadas e de plântulas advindas de sementes foram ex-traídas com 500 mL de methanol. Foi preparado um ex-trato metanólico, o qual foi centrifugado a 10.000 rpm por 5 min. O sobrenadante (20 mL) foi analisado por CLAE, utilizando-se um cromatógrafo Shimadzu (LC6A) com detector UV SPD-6AV, coluna Shim-Pack ODC-18 (4.5 x- 250 μM); sistema eluente 30:70 a 60:40 MeOH:H²O (15 min) gradiente linear, visualização a 265 nm, modo isocrático, mantido por 20 min. O goyazensolide, centratherine, 15-diox-y-goyazensolide e padrões de eremantolide utilizados nesse ex-perimento foram isolados de L. ericoides in natura, de acordo com a metodologia descrita por Sakamoto et al. (2003) e dos Santos et al. (2004).

Resultados e Discussão

O desenvolvimento de protocolos de micropropagação de plantas é particularmente útil em programas de conservação, quando a metodologia para produção em larga escala ainda não foi estabelecida, ou quando as sementes da espécie em estudo são recalcitrantes, possuem baix-a viabilidade ou perdem sua viabilidade em pouco tempo (SCHUMACHER, 1991). O ex-perimento realizado com sementes de L ericoides (Tabela 1) mostrou que a presença de embriões nas sementes é baix-a (menor que 30%) e a porcentagem de embriões capazes de se desenvolver também é reduzida (menor que 50%). Independente da população analisada, o número de indivíduos obtidos por sementes foi menor que 10%. Estes dados estão de acordo com os obtidos por Paron et al. (1999), que relatou que apenas 7% das sementes de L. ericoides são viáveis.

As gemas apicais de plantas coletadas em Ibiraci, cultivadas em meio de MS sem regulador de crescimento, contaminaram 97% (± 3), as de Delfinópolis 95% (± 4), e as de Furnas 91% (± 5). Já os diásporos coletados em Ibiraci contaminaram 83% (± 8), os de Delfinópolis 79% (± 9), e os de Furnas 85% (± 10). Os embriões isolados mostraram menores percentagens de contaminação em relação aos ex-plantes advindos de gemas apicais ou diásporos, portanto é recomendado que os primeiros sejam utilizados como ex-plantes para introdução de acessos desta espécie em banco de germoplasma in vitro. O alto teor de contaminação observado para esta espécie é próprio do ambiente onde ela é encontrada, que é caracterizado por uma grande diversidade de fungos, bactérias, micorriza e liquens. Segundo Leifert e Waites (1994), ex-plantes de plantas crescidas no campo podem, em alguns casos, tornarem-se difíceis ou impossíveis de desinfetar, devido à presença de microrganismos endofíticos e epifíticos.

Os resultados obtidos nos ex-perimentos com diferentes concentrações (1.11 - 8.88 μM) de BAP mostraram que não ex-istiu diferença significativa quanto ao número de brotos, porém concentração mais baix-a de BAP propiciou elongação de broto (1,02 cm) e foi portanto considerado o meio mais apropriado para o desenvolvimento in vitro (Tabela 2). As plantas coletadas em Ibiraci, Delfinópolis ou Furnas enraizaram in vitro, porém os acessos coletados em Furnas apresentaram um índice mais baix-o de enraizamento e um número menor de raízes. O meio MS suplementado com 4,92 μM ABI foi o meio mais adequado para induzir o enraizamento (Tabela 3). Tanto as plântulas com ou sem raízes, quando transferidas para a casa de vegetação, mostraram crescimento semelhante, e depois de 3 meses as plântulas sem raiz desenvolveram o sistema radicular. A porcentagem de sobrevivência foi de aprox-imadamente 83,3% (± 3) para as plântulas de Ibiraci, 72,4% (± 5) para as de Furnas e 70,8% (± 9) para as de Delfinópolis.

As análises por CLAE dos ex-tratos das plântulas micropropagadas e de plântulas advindas de sementes mostraram perfis químicos semelhantes (Figuras 1 e 2). Além disso, ex-tratos de plântulas in vitro mostraram a presença de goiazensolideo, um furanoheliangolideo inibidor do fator da transcrição NF-kB, considerado um potente agente antiinflamatório (RUNGELER et al., 1999).

A conservação de L. ericoides em banco de germoplasma in vitro foi possível, conforme está demonstrado na Tabela 4. O crescimento foi limitado em meio MS/2 contendo 2% sacarose e 4% sorbitol. Collin e Edwards (1998) recomendaram a redução de sais pela metade como uma forma para reduzir o crescimento. Todavia este não foi um procedimento eficaz para a conservação in vitro de L. ericoides, uma vez que a redução de sais do meio MS promoveu o desenvolvimento de ex-plantes. Contudo, a combinação de MS/2 e sorbitol protegeram 96.6% das plântulas das condições de estresse do banco de germoplasma. Todavia, são necessários estudos em longo prazo para assegurar que estresses abióticos ambientais como a alta concentração de sais e a ex-cessiva pressão osmótica não induzirão anomalias morfológicas e fisiológicas. Concluindo, este protocolo é uma ferramenta útil para propagação em massa de arnica-da-serra, e pode servir como um modelo para conservação ex situ de espécies medicinais do cerrado, especialmente aquelas consideradas em ex-tinção. Este é o primeiro relato sobre a propagação in vitro da espécie Lychnophora ericoides. O banco de germoplasma in vitro assegurará a preservação da diversidade de populações remanescentes dessa espécie.

Referências

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