Estudo farmacobotânico das folhas de Aspidosperma excelsum Benth. (Apocynaceae)

Resumo

Aspidosperma excelsum Benth. (Apocynaceae) é uma planta nativa da Amazônia brasileira, usada na medicina tradicional à base de plantas, especialmente para o tratamento de malária. Neste trabalho foram realizadas análises anatômicas, histoquímicas, fitoquímicas, fisícas e físico-químicas com as folhas de A. excelsum, visando auxiliar em sua distinção taxonômica, além de fornecer parâmetros de qualidade para futuros estudos farmacognósticos com a espécie. Amostras de folhas foram coletadas em Santa Bárbara, Estado do Pará. Para as análises estruturais e histoquímicas foram utilizadas técnicas usuais em anatomia vegetal. Algumas classes de metabólitos secundários foram detectadas a partir de Cromatografia de Camada Delgada. Os parâmetros físicos e físico-químicos foram avaliados a partir de análises de granulometria, teor de cinzas totais, cinzas insolúveis em ácido, umidade e pH. A folha de A. excelsum possui face abaxial com cutícula ornamentada, tricomas tectores, laticíferos articulados ramificados e idioblastos com conteúdo cristalífero e acidófilo. A análise histoquímica revelou que os idioblastos apresentam composição heterogênea, como compostos fenólicos, taninos, alcaloides e lipídeos. A análise fitoquímica confirmou uma presença destas substâncias, além de heterosídeos flavônicos e esteroides. Os testes físicos e físico-químicos são dados inéditos para as folhas de A. excelsum.

Palavras-chave:

Amazônia.

Carapanaúba.

Laticíferos.

Abstract

Aspidosperma excelsum Benth. (Apocynaceae) is a Brazilian Amazon native plant used in traditional herbal medicine, especially for the treatment of malaria. In this work, anatomical, histochemical, phytochemical, physical and physicochemical analysis were performed with the A. excelsum leaves to assist in their taxonomic distinction, in addition to provide quality parameters for future pharmacognostical studies with this species. Leaf samples were collected in Santa Bárbara, State of Pará. For structural and histochemical analysis, usual techniques in plant anatomy were used. Some classes of secondary metabolites were detected from Thin Layer Chromatography. The physical and physicochemical parameters were evaluated from granulometry, total ash, acid insoluble ash, humidity and pH analysis. The A. excelsum leaf has abaxial face with ornate cuticle, tector trichomes, articulated branched laticifer and idioblasts with cristaliferous and acidophilus content. The histochemistry analysis revealed that the idioblasts presented heterogeneous composition, such as phenolic compounds, tannins, alkaloids and lipids. The phytochemical analysis confirmed the presence of these substances, in addition to flavonic heterosides and steroids. The physical and physicochemical tests are new data to the A. excelsum leaves.

Key-words:

Amazonia.

Carapanauba.

Laticifers.

Introdução

O gênero Aspidosperma Mart & Zucc. (Apocynaceae) tem sido alvo de intensas investigações fitoquímicas e farmacológicas. Espécies deste gênero são utilizadas por populações tradicionais, como antiparasitários, anti-inflamatórios e antineoplásicos (OLIVEIRA et al., 2009; BANNWART et al., 2013; PAULA, DOLABELA e OLIVEIRA, 2014).

Dentre as espécies do táxon ocorrentes na região amazônica, destaca-se Aspidosperma excelsum Benth., conhecida popularmente por carapanaúba. Suas cascas são utilizadas em infusão e decocção para o tratamento de malária e febres em geral (MILLIKEN, 1997; BARBOSA, TAVARES e SOARES, 2003; OLIVEIRA et al., 2003). As propriedades terapêuticas de A. excelsum são atribuídas, principalmente aos alcaloides indólicos, 22 destes já foram isolados (PEREIRA et al., 2007). Apesar de amplamente utilizada, A. excelsum não possui monografia na Farmacopeia Brasileira que estabeleça parâmetros de autenticidade e grau de pureza para o seu uso seguro.

Estudos fitoquímicos de extratos obtidos das cascas de A. excelsum levaram ao isolamento de ioimbina, O-acetilioimbina, excelsinina, O-acetilexcelsinina, 16-epi-excelsinina (BENOIN, BURNELL e RIEDIN, 1967; BURNELL e NGUYÊN-THI-SEN, 1971).

Sabe-se que as folhas de A. excelsum apresentam componentes similares e/ou distintos aos encontrados nas cascas (AÑEZ, 2009). E por constituírem o órgão mais abundante do vegetal, seu uso poderia desviar o foco sobre a coleta extensiva da casca, diminuir danos ocasionados à planta e consequentemente o risco de extinção da espécie (ALMEIDA e ALBUQUERQUE, 2002).

Segundo revisões taxonômicas mais recentes, A. acanthocarpum Markgr., A. aquaticum Ducke, A. auriculatum Markgr., A. marcgravianum Woodson e A. nitidum Benth. ex Müll. Arg., são sinônimos heterotípicos de A. excelsum Benth.(KOCH et al., 2014). Na Amazônia brasileira é comum o uso do mesmo nome vernacular para espécies distintas de Aspidosperma Mart. & Zucc. (REIS, 2015). O termo carapanaúba é comumente usado para A. excelsum Benth., A. carapanauba Pichon e A. discolor A. DC.. Todas estas espécies apresentam troncos sulcados e morfologia muito semelhante, o que dificulta a distinção taxonômica das mesmas em campo. O uso de técnicas de anatomia vegetal, para descrever a microestrutura das folhas de A. excelsum, é uma alternativa segura, para distingui-la de outras espécies do gênero (REIS, POTIGUARA e REIS, 2013).

O objetivo deste estudo foi caracterizar a anatomia foliar de A. excelsum, visando subsidiar sua identidade botânica. Além de realizar análises histoquímicas, fitoquímicas, fisícas e físico-químicas, para que possam auxiliar em futuros estudos farmacognósticos com a espécie.

Materiais e Métodos

Material vegetal

Partes vegetativas aéreas de Aspidosperma excelsum Benth., foram coletadas no município de Santa Bárbara do Pará (S 01º 10' 94.6", W 048º 11' 71.5") em maio de 2013. A identificação da espécie foi confirmada pelo especialista do gênero, Dr. Washington Marcondes Ferreira-Neto (Herbário UEC). Uma exsicata foi incorporada ao Herbário MG do Museu Paraense Emílio Goeldi, sob registro MG 206608.

Amostras da região mediana da lâmina foliar e pecíolo foram utilizados nas análises anatômicas. E 1,5kg de folhas para análises fitoquímicas, físicas e físico-químicas. As folhas foram higienizadas, secas em estufa de ar quente a 40°C e trituradas em moinho de facas de aço inoxidável. O pó obtido foi armazenado em frascos hermeticamente fechados.

Análise em microscopia óptica e eletrônica de varredura

Amostras foram fixadas em FAA₅₀ (formaldeído PA, ácido acético PA e etanol 50%, 1:1:1, v/v) (JOHANSEN, 1940) e FNT (Formalina neutra tamponada) (LILLIE, 1965). Posteriormente, foram desidratadas em série butílicas (JOHANSEN, 1940) e incluídas em parafina histológica e 2-hidroxietil-metacrilato (Historesin Leica®), segundo especificações do fabricante. Secções transversais, longitudinais e paradérmicas (12-18 μm de espessura) foram obtidas em micrótomo de avanço automático (Leica® RM 2245, Nussloch, Alemanha), coradas com safranina, azul de astra (GERLACH, 1969) e tripla coloração de Flemming (JOHANSEN, 1940) ao final foram montadas em resina sintética (Permount®, New Jersey, USA).

Na dissociação da epiderme da lâmina foliar, foi utilizado hipoclorito de sódio 2% (JOHANSEN, 1940). A maceração foi realizada segundo Franklin (1945).

Para análises de microscopia eletrônica de varredura (MEV), amostras foram desidratadas em série etanólica crescente (JOHANSEN, 1940), secas em ponto críticas de CO₂ (BOZZOLA e RUSSEL, 1991), montadas em suportes metálicos (stubs) e metalizadas com ouro. As imagens foram obtidas em microscópio eletrônico LEO modelo 1450 VP.

Análise histoquímica

Amostras foram incluídas em paraplast (KRAUS e ARDUIN, 1997). As classes de metabólitos secundários foram caracterizadas com os seguintes testes e respectivos controles realizados simultaneamente: Sudam Black B (PEARSE, 1985) para lipídios totais, Sulfato Azul do Nilo (CAIN, 1947) para lipídios ácidos e neutros, Acetato de Cobre/Ácido Rubeânico (GANTER e JOLLÉS, 1970) para ácidos graxos, Reagente de Nadi (DAVID e CARDE, 1964) para terpenos, Cloreto Férrico (JOHANSEN, 1940) para compostos fenólicos totais, Reagente de Dragendorff (SVENDSEN e VERPOORTE, 1983) para alcaloides, Ácido tânico/Cloreto Férrico (PIZZOLATO e LILLIE, 1973) para mucilagens, Vanilina Clorídrica (MACE e HOWELL, 1974) para taninos e Lugol (JOHANSEN, 1940) para amido.

As fotomicrografias foram obtidas em câmera digital Cannon modelo A65015, acoplada em microscópio Zeiss modelo 426126.

A terminologia utilizada para a descrição anatômica seguiu Metcalfe e Chalk (1950) e Demarco, Kinoshita e Castro (2006).

Obtenção dos extratos e frações

Um quilograma de pó foi submetido à percolação exaustiva com etanol 92,8ºGL (F. FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010). A partir do extrato etanólico das folhas de A. excelsum (EEAE) foram preparadas frações com solventes de polaridades crescentes: diclorometano (DCM), acetato de etila (AcOEt) e metanol (MeOH). O extrato e frações foram concentrados até resíduo em evaporador rotativo (modelo Q344B1 QUIMIS®) equipado com bomba hidrovácuo (modelo Q355A2 QUIMIS®) em temperatura média de 60°C.

Para detectar a presença de alcaloides,  realizou-se extrações seletivas acidobásicas com DCM, sendo o pó tratado previamente com HCl (1N) e NH₄OH, ao final os extratos foram concentrados até resíduo (HENRIQUES et al., 2010).

Prospecção fitoquímica por Cromatografia de Camada Delgada (CCD)

Foram utilizadas a solução de 1mg de EEAE em 1mL de MeOH e cromatoplacas de sílica gel 60G F254 Merck em folhas de alumínio, visando detectar a presença dos seguintes grupos de metabólitos: cumarinas, geninas antracênicas e naftoquinônicas, heterosídeos antracênicos, triterpenos/esteroides, saponinas, geninas flavônicas, heterosídeos flavônicos, alcaloides, glicosídeos cardiotônicos, taninos e polifenois. Para cada grupo foi utilizado um sistema eluente adequado, reveladores específicos e amostras de referência (WAGNER, BLADT e ZGAINSKY, 1984).

Análises física e físico-química

Determinações de distribuição granulométrica, teor de cinzas totais, cinzas insolúveis em ácido e pH foram realizadas segundo especificações da Farmacopeia Brasileira (2010). Adicionalmente, foi aplicado índice de Sauter para classificar o tamanho das partículas de pó, e Infrateste para determinação de umidade (BORGES et al., 2005).

Resultados

Análises Anatômicas          

A superfície adaxial da lâmina foliar em vista frontal possui células com paredes anticlinais retas a ligeiramente sinuosas (FIGURA 1B). A cera epicuticular ocorre em placas contínuas paralelas à superfície epidérmica na face adaxial e em projeções na face abaxial (FIGURAS 1A e 1C). As folhas são hipoestomáticas com estômatos anomocíticos (FIGURA 1D). Foram observados dois morfotipos de tricomas tectores simples com indumento granuloso em ambas as faces da lâmina foliar. O primeiro é longo com ápice afilado e observado apenas sobre a nervura central (FIGURA 1E). O segundo é curto com ápice agudo e localizado disperso sobre a lâmina foliar (FIGURA 1F). Na face adaxial foram encontradas apenas cicatrizes (FIGURA 1B). As células epidérmicas que cerceiam as bases dos tricomas são alongadas radialmente e dispostas em roseta (FIGURA 1D).

A lâmina foliar em secção transversal apresenta epiderme uniestratificada, coberta por cutícula espessada em ambas as faces. A margem foliar é ligeiramente dobrada para a face abaxial e possui células epidérmicas semelhantes a papilas (FIGURA 2A).

O mesofilo é dorsiventral, com uma camada de parênquima paliçádico e seis a oito de parênquima esponjoso. A vascularização consiste de feixes colaterais envoltos por endoderme contendo cristais prismáticos. Esclereídes colunares e macroesclereídes são abundantes e atravessam o mesofilo (FIGURAS 2B, 2E).

A nervura central em secção transversal é plano-convexa. Os feixes vasculares são bicolaterais e seguem o formato da nervura. Braquiesclereídes estão dispersos no parênquima fundamental (FIGURA 2C).

O pecíolo em secção transversal é plano-convexo. A vascularização consiste de feixes bicolaterais que seguem o formato do pecíolo. Macro e braquiesclereídes isolados e agrupados ocorrem no córtex parenquimático (FIGURAS 2D, 2E).

Idioblastos secretores com conteúdo acidófilo e cristalífero foram observados dispersos, principalmente no parênquima fundamental da nervura central e do pecíolo. Os idioblastos cristalíferos apresentam cristais prismáticos (FIGURA 2F).

Laticíferos simples e laticíferos articulados ramificados foram observados na lâmina foliar. Os simples ocorrem no mesofilo (FIGURA 2G), nervura central e pecíolo. Os articulados ramificados ocorrem apenas no mesofilo (FIGURA 2H). Ambos os tipos de laticíferos são alongados e constituídos por parede primária com crescimento intrusivo entre as células parenquimáticas e esclereídes.

A análise histoquímica dos idioblastos foliares mostrou que o conteúdo é heterogêneo. Foram identificados: alcaloides, compostos fenólicos, lipídeos e oxalato de cálcio (TABELA 1).

Análises fitoquímicas

A prospecção fitoquímica realizada por CCD revelou a presença de taninos e polifenois, heterosídeos flavônicos, triterpenos, esteroides e alcaloides. As bandas reveladas apresentaram fatores de retenção (FR) distintos, evidenciando tratar-se de substâncias diferentes (FIGURA 3).

Análises física e físico-química

O pó das folhas de A. excelsum apresentou diâmetro médio de 936 µm, sendo classificado como grosso. Os teores de cinzas totais e de umidade foram elevados. A infusão das folhas de A. excelsum obteve pH de 5.57. O teor de extrativos foi considerado satisfatório (TABELA 2).

Discussão

Aspidosperma excelsum apresenta características conservativas à família Apocynaceae, tais como: epiderme uniestratificada, ornamentação da cera epicuticular, organização do mesofilo e pecíolo, além da localização e o tipo de estômatos, tricomas, laticíferos e idioblastos secretores (SOLEREDER, 1908; METCALFE e CHALK, 1950; CRONQUIST, 1981).

Idioblastos secretores e laticíferos foram as únicas estruturas secretoras observadas nas folhas de A. excelsum, assim como em Parahancornia fasciculata (Poir) Benoist(SANTOS et al., 2013)e em espécimes de Mandevilla Lindl. (MARTINS e ALVES, 2008). A ocorrência de laticíferos articulados ramificados é um dado inédito para A. excelsum, sendo relatado somente para A. autrale Müll. Arg. (DEMARCO, KINOSHITA e CASTRO, 2006). Esta é uma característica particular, já que na maioria das espécies de Apocynaceae, os laticíferos são classificados como não articulados (SOLEREDER, 1908; METCALFE, 1967; YODER e MAHLBERG, 1976).

O elevado teor de cinzas totais das folhas de A. excelsum não constituem impurezas inorgânicas, visto que as análises estruturais mostraram a presença de idioblastos com cristais de oxalato de cálcio. Segundo Rao e Xiang (2009) os elevados teores de cinzas totais em algumas espécies podem ocorrer devido a presença de cristais de oxalato de cálcio. Colocam, ainda, que a análise de cinzas totais para aferição de controle de qualidade de drogas vegetais é insuficiente, sendo necessária a quantificação de cinzas insolúveis em ácido, como realizado no presente estudo. Além disso, como as amostras de A. excelsum foram coletadas em ambiente de várzea e, sabendo que plantas aquáticas ou sujeitas a inundações são sorventes naturais de substâncias inorgânicas, este fator pode ter influenciado na maior absorção de substâncias inorgânicas, elevando o teor de cinzas totais em A. excelsum (RUBIO et al., 2004).

O pH baixo da infusão das folhas de A. excelsum expressa a presença de substâncias ácidas nas folhas, devido, provavelmente, a presença de conteúdo acidófilo nos idioblastos secretores.

A heterogeneidade química dos idioblastos secretores constatados através da histoquímica está consonante com a fitoquímica. Por meio das duas técnicas foram detectados: alcaloides, compostos fenólicos totais (taninos, polifenóis e heterosídeos flavônicos), lipídeos totais e ácidos, ácidos graxos, triterpenos, esteroides e oxalato de cálcio nas folhas de A. excelsum. Segundo Evans (2002) os metabólitos secundários mais encontrados na família Apocynaceae são alcaloides indólicos, esteroidais e beta-carbolininos, glicosídeos cardioativos, glicosídeos cianogenéticos, leucoantocianinas, saponinas, taninos, comarinas, ácidos fenólocos, ciclitois e triterpenos. No que concerne ao gênero Aspidosperma, estudos relataram a predominância de alcaloides indólicos (BOLZANI et al., 1987; PEREIRA et al., 2006; PEREIRA et al., 2007).

Análises fitoquímicas realizadas por Añez (2009) revelaram a presença de compostos fenólicos, triterpenos, esteroides e glicosídeos cadioativos nas folhas de A. marcgravianum Woodsone A. nitidum Benth. ex Müll. Arg., além de cumarinas nesta última espécie. Pacheco (1979) também encontrou alcaloides nas folhas de A. pyrifolium Mart.

A CCD de triterpenos e esteroides, revelou substância com fator de retenção (FR) muito semelhante ao do triterpenoide lupeol, sugerindo que Aspidosperma excelsum possa conter esta substância, já isolada de A. nitidum (sinônimo botânico de A. excelsum) (PEREIRA et al., 2006), A. parvifolium A. DC. (JÁCOME et al., 2004) e Parahncornia fasciculata Poir (SILVA, 2012). Lupeol é comum em uma variedade de plantas terapêuticas e mostrou atividade contra Plasmodium, Leishmania e Trypanosoma (FOURNET et al., 1992; ALVES et al., 1997; GALLO e SARACHINE, 2009).

Com relação aos heterosídeos flavônicos, foi detectada substância com FR semelhante ao da rutina (amostra referência), constituinte já isolado das folhas de A. macrocarpon Mart. (BANNWART et al., 2013).

Apesar do baixo nível de detecção, a análise histoquímica revelou a presença de alcaloides. Na análise fitoquímica, entretanto, esta classe de metabólitos secundários não foi detectada no EEAE, estando presente apenas na extração seletiva para alcaloides. Isto pode sinalizar que, possivelmente, os alcaloides apresentam-se em concentrações muito reduzidas em folhas adultas, ou seja, sintetizados nas estruturas secretoras das folhas e translocados para a casca, local de maior armazenamento em A. excelsum. O local de armazenamento não necessariamente constitui o de síntese (SEIGLER, 1998).

Vinte e três extratos com solventes distintos foram obtidos por Dolabela e colaboradores (2012) a partir de órgãos vegetativos e reprodutivos de seis espécies de Aspidosperma, estes foram avaliados por CCD quanto à presença de alcaloides. Apenas os extratos etanólico e de DCM das folhas de A. ramiflorum A. DC. mostraram-se positivos para a classe, contudo todos os extratos obtidos a partir da casca das seis espécies revelaram a presença de alcaloides. Além disso, os mesmos apresentaram atividade biológia in vitro contra Plasmodium falciparum resitente e sensível a cloroquina.

Considerando que foram usadas folhas adultas nesta investigação, são necessários mais estudos, principalmente ontogenéticos dos primórdios foliares, para melhor avaliação morfológica e química dos laticíferos, estudos de isolamento de alcaloides das folhas, bem como de suas rotas metabólicas responsáveis pela síntese e armazenamento nos órgãos de A. excelsum. Alcaloides, frequentemente se acumulam em locais particulares das plantas, e muitas vezes são transportadas do órgão de origem para o de armazenamento, suas vias metabólicas são influenciadas por vários fatores como: fisiologia, meio abiótico e expressão de rotas gênicas células-tecidos específicos e, ainda, pela biosíntese intermediada entre diferentes organelas e células (SEIGLER, 1998; YU e DE LUCA, 2014).

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e ao Projeto Rede de Produtos Naturais para a Quimioterapia Antimalárica (Processo: 555655/2009-1), pelo apoio financeiro; À Dra. Alba Lúcia Lins pela autorização de uso do Laboratório de Anatomia Vegetal; À Msc. Tarcymara Garcia pelo auxílio na microscopia eletrônica de varredura. Ao Dr. Geraldo Célio Brandão, Msc. Douglas Gontijo e a técnica Raquel Isidório por auxiliarem nos experimentos fitoquímicos no Laboratório de Fitoquímica (UFMG) e à técnica Lidiane Diniz pelo apoio nos experimentos físicos e físico-químicos no Laboratório de Fitoquímica do Museu Paraense Emílio Goeldi.

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