Fungos Endofíticos. Potencial para a Produção de Substâncias Bioativas

Resumo

Os microrganismos, em especial os fungos têm sido uma fonte significativa de substâncias para uso terapêutico. Os fungos endofíticos, que habitam os tecidos internos de espécies vegetais e apresentam importante interação com o hospedeiro, podem, provavelmente devido ao que parece ser a sua contribuição ao hospedeiro, produzir uma pletora de moléculas a serem explorados em medicamentos. As plantas medicinais têm sido recentemente alvos de investigações relacionadas a seus fungos endofíticos e metabólitos secundários. Além da possibilidade de produzir a mesma substância sintetizada por seus hospedeiros ou análogos bioativos, esses microrganismos são capazes de sintetizar novas moléculas com atividade antibacteriana, antifúngica, anticâncer e imunossupressora, entre outras.

Unitermos:

fungos endofíticos.

plantas medicinais.

produtos naturais bioativos.

metabólitos secundários..

Abstract

Microorganisms, in special fungi, have been a most significant source of drugs for therapeutic use. Endophytic fungi, which reside in the tissues of virtually all living plants and present important interaction with the host, because of what appears to be their contribution to the host plant, may produce a plethora of substances of potential use as medicine. Medicinal plants have been recently subject of investigations related to their endophytic fungi and their secondary metabolites. Besides the possibility of producing the same substance as the host plant or a bioactive analogous, these microorganisms may synthesize novel molecules with antibiotic, antimycotic, immunosuppressant, anticancer, and other activities.

Key words:

endophytic fungi.

medicinal plants.

bioactive natural products.

secondary metabolites..

Introdução

Os microrganismos, em especial os fungos, apresentam capacidade metabólica de produzir uma grande diversidade de moléculas bioativas e são atualmente utilizados para produzir inúmeros produtos comerciais com um mercado estimado na casa de bilhões de dólares. A comercialização de produtos terapêuticos microbianos iniciou-se com a descoberta da penicilina há 70 anos. Inicialmente empregados apenas como agentes antibacterianos, esses produtos evoluíram para os mais diferentes usos, nos quais se inclui a inibição da biossíntese de colesterol e terapias tão sofisticadas quanto de imunossupressão em pacientes transplantados (BULL et al., 1992; PEARCE, 1997; CRAGG; NEWMAN, 2001). Este avanço relaciona-se com o isolamento de novas culturas a partir de uma ampla variedade de ambientes e substratos; o atual entendimento de muitas doenças a nível bioquímico e genético, o que torna possível a busca de metabólitos microbianos com ação direcionada para alvos específicos no metabolismo celular; o avanço recente das técnicas químicas, que tornaram o isolamento e caracterização destes compostos muito mais rápidos. Em adição, existe atualmente uma grande tendência para a produção de drogas por processos fermentativos, alicerçada pelo desenvolvimento da biologia molecular, em função de possíveis vantagens técnicas, econômicas, energéticas e ambientais. A Tabela 1 apresenta alguns exemplos de produtos com atividade farmacológica obtidos por fermentação fúngica.

Apesar da variedade de agentes terapêuticos derivados de fungos, esta é uma área com enorme potencial e em franca expansão, visto que estimativas indicam a existência de 1,5 milhões de espécies de fungos, dos quais somente 5% estão descritos na literatura (HAWKSWORTH, 1991). Mesmo esses últimos ainda não tiveram seu potencial extensivamente explorado.

Os fungos endofíticos, que habitam o espaço intercelular de espécies vegetais vivas, são relativamente pouco estudados e apresentam um grande potencial para exploração em medicina, agricultura e indústria. O presente trabalho enfoca especialmente os fungos endofíticos de plantas medicinais e seu potencial para a obtenção de produtos naturais com atividade biológica.

Fungos endofíticos

Microrganismos endofíticos são aqueles que, pelo menos durante parte de seu ciclo de vida, colonizam assintomaticamente os tecidos vivos internos de plantas. Estes organismos apresentam importante interação com a planta hospedeira, podendo conferir-lhe aumento de resistência a herbivoria, a patógenos e a outros estresses abióticos, ou ainda melhorar sua capacidade competitiva. Em contrapartida, os endófitos podem receber proteção e nutrientes do hospedeiro (PETRINI et al., 1992; SAIKKONEN et al., 1998; STROBEL; DAISY, 2003; SELOSSE et al., 2004). Embora existam controvérsias, a definição acima de endofíticos é a mais amplamente aceita atualmente. O significado do termo endofítico tem passado por transformações ao longo das duas últimas décadas. Diversos autores consideram que a distinção entre microrganismos patógenos e mutualistas não é clara e que as interações entre microrganismo e planta hospedeira podem variar entre e dentro de populações e comunidades (PETRINI, 1986; CARROL, 1995; SAIKKONEN et al., 1998; GUNATILAKA, 2006).

Fungos e bactérias, incluindo os actinomicetos, podem existir em plantas como endófitos. Os fungos, entretanto, são os mais freqüentemente isolados (STROBEL; DAISY, 2003). Todos os vegetais superiores estudados até o momento apresentaram microrganismos endofíticos, sendo possível o isolamento de um grande número de espécies a partir de um único hospedeiro. Entretanto, somente algumas, normalmente as espécies e/ou linhagens específicas do hospedeiro, estão presentes em quantidades significativas. As pesquisas desenvolvidas na área têm demonstrado que cada hospedeiro abriga um conjunto característico de endofíticos e que os endofíticos de um dado hospedeiro são geralmente específicos. A composição e freqüência, entretanto, podem ser significativamente afetadas por fatores tais como: grau de umidade ambiental, distribuição geográfica (têm sido observadas diferenças bastante significativas na microbiota endofítica de espécies vegetais fora de seu habitat natural), posição relativa na planta (altura em relação ao solo), idade da planta, órgão da planta, entre outros (PETRINI et al., 1992; CARROL, 1995; RODRIGUES; PETRINI, 1997; SAIKKONEN et al., 1998).

Importância dos fungos endofíticos

Embora o primeiro endofítico tenha sido descoberto em 1904, os estudos sobre este grupo de microorganismos intensificaram-se a partir da década de 80, tornando cada vez mais evidente sua relevância ecológica e seu potencial para a obtenção de metabólitos com estruturas e funções biológicas diversificadas. Entre as aplicações vislumbradas para os microrganismos endofíticos, destaca-se a sua utilização como agentes no controle biológico de pragas e de ervas daninhas; a utilização como vetores para a introdução de genes de interesse em espécies de plantas economicamente importantes; produção de enzimas; e obtenção de metabólitos secundários com potencial terapêutico (PEARCE, 1997; STROBEL; LONG, 1998; GUNATILAKA, 2006).

A produção de substâncias biologicamente ativas por fungos endofíticos está relacionada à sua capacidade de sobrevivência e colonização de um micro ambiente distinto, sujeito às constantes interações metabólicas e ambientais, esta freqüentemente hostil. Nas últimas duas décadas, mais de 100 microrganismos endofíticos foram cultivados e investigados, levando à caracterização química e avaliação da ação biológica de um grande número de produtos naturais, muitos dos quais apresentaram novas estruturas e interessantes atividades biológicas (GUTATILAKA, 2006).

Fungos endofíticos, biodiversidade e produtos bioativos

Dos inumeráveis ecossistemas do planeta, aqueles com maior biodiversidade são também os que têm apresentado endofíticos em maior quantidade e com maior diversidade, o que significa, em última instância, maior diversidade química. Muitos micologistas concordam que a diversidade fúngica apresenta seu ápice nas florestas tropicais (ARNOLD et al., 2000). Com relação às substâncias bioativas produzidas pelos fungos, especialmente os endofíticos, a localização geográfica parece ser também relevante. Estudos estatísticos realizados por BILLS et al. (2002) indicaram que os endofíticos de regiões tropicais provêm um número maior de moléculas ativas do que os endofíticos de clima temperado. O estudo apontou também que fungos endofíticos de regiões tropicais produzem um número maior de metabólitos secundários ativos em relação a fungos isolados de outros hábitats tropicais. Algumas estratégias vêm sendo empregadas para racionalizar a busca de endofíticos interessantes em meio à miríade de plantas. Assim, as espécies vegetais para estudo têm sido selecionadas com base nos seguintes critérios: plantas de ambientes peculiares, especialmente aquelas com biologia e com estratégias de sobrevivência incomuns; plantas com histórico etnobotânico, isto é, aquelas utilizadas tradicionalmente como medicamento; plantas endêmicas, com longevidades incomuns ou então localizadas em ambientes ancestrais; plantas de ambientes com grande diversidade (STROBEL, 2002; STROBEL; DAISY, 2003).

Isolamento e identificação de microorganismos endofíticos

O isolamento de microrganismos endofíticos envolve uma etapa inicial de esterilização da superfície do tecido do hospedeiro, que tem como objetivo a eliminação da comunidade externa (epifítica) da amostra vegetal, mantendo viável a comunidade interna. Nesta etapa normalmente são utilizados produtos químicos, como etanol 70% e hipoclorito de sódio 3%, podendo ainda ser utilizados métodos físicos, como flambagem e irradiação com luz ultravioleta. Em seguida, com auxílio de uma lâmina estéril, os tecidos externos são removidos da amostra e os tecidos internos são fragmentados e aplicados sobre meios de cultura gelificados em placas. Após incubação, as colônias microbianas são transferidas para outros meios visando a obtenção de culturas puras para posterior identificação (BACON, 1988; ARAUJO et al., 2002; STROBEL; DAISY, 2003). A identificação de fungos filamentosos baseia-se principalmente nas características morfológicas das estruturas reprodutivas sexual e assexual; podendo também se empregar técnicas de biologia molecular, como seqüenciamento de regiões espaçadoras do DNA ribossomal e comparação com uma base de dados (ARAUJO et al., 2002).

Microrganismos endofíticos de plantas medicinais

A busca por endofíticos e seus metabólitos secundários bioativos tem enfocado ativamente as plantas medicinais, por diversos motivos. É razoável supor que a atividade farmacológica de algumas espécies vegetais poderia estar relacionada a substâncias produzidas por fungos endofíticos ou pela planta em resposta à infecção fúngica. Desta forma, a época de colheita da planta ou o cultivo fora de seu habitat natural poderiam causar interferências em sua atividade farmacológica. Pode-se ainda inferir que plantas medicinais contenham microrganismos que mimetizem a química do hospedeiro e que sejam capazes de produzir o mesmo produto natural bioativo ou, até mesmo, derivados com maior bioatividade (STROBEL et al., 2002; STROBEL; LONG, 1998). Esta possibilidade permitiria a obtenção destes compostos por processos fermentativos, em contraposição aos processos extrativos tradicionais, com vantagens relacionadas à regularidade e uniformidade de produção e aos ganhos ambientais.

Neste contexto, é importante mencionar o taxol, a primeira droga anticâncer a alcançar um mercado mundial de um bilhão de dólares, encontrada em quantidades extremamente pequenas na casca interna de espécies de Taxus, árvore de crescimento lento de regiões do noroeste do Pacífico. Foram isolados, a partir dessas espécies vegetais, fungos endofíticos capazes de produzir o taxol, abrindo a possibilidade de sua obtenção por via fermentativa, com custos mais baixos e maior disponibilidade (LI et al., 1996; LI et al., 1998; STROBEL et al., 1996a,b). Posteriormente, foram descobertos outros fungos endofíticos, isolados de plantas que não Taxus sp., capazes de produzir o taxol, sugerindo que esta substância, que é um fungicida, teria a função de proteger a planta hospedeira de patógenos como os fungos aquáticos oomicetos (LI et al., 1996; LI et al., 1998; STROBEL et al., 1996a,b). Outro exemplo de substância bioativa extraída de plantas e que pode ser obtida por cultivo de fungo endofítico é a podofilotoxina, sintetizada pelas espécies vegetais em extinção Podophyllum spp. e com aplicação como anticâncer, antiviral, antibacteriano, imunoestimulador e antireumático. Esta substância apresenta grande demanda mundial devido ao seu uso na síntese de inibidores da topoisomerase. Recentemente, foi reportado o isolamento do fungo endofítico Trametes hirsuta a partir de P. hexandrum; espécie esta que produz podofilotoxina e outras lignanas biologicamente ativas, com propriedades antioxidante, anticâncer e radioprotetora (PURI et al., 2006). São também conhecidos medicamentos tradicionais de uso popular cuja atividade é proveniente de substâncias produzidas por fungos associados a plantas, como os alcalóides “ergot”, que atuam como estimuladores da contração uterina, produzidos pelo fungo Claviceps purpurea (BACON, 1988). Finalmente, os fungos endofíticos de plantas medicinais são, por si só, uma fonte potencial de novas substâncias para uso como agentes terapêuticos.

A consulta ao serviço de busca Pubmed leva a cerca de 450 artigos publicados sobre fungos endofíticos, dos quais cerca de 30% abordam os metabólicos fúngicos com respeito a sua atividade biológica. Muitos desses trabalhos enfocam especificamente a atividade biológica de metabólitos produzidos por fungos endofíticos isolados de plantas medicinais. A Tabela 2 apresenta alguns exemplos recentes. É interessante notar que grande parte dessas substâncias apresenta atividade antimicrobiana. Este comportamento, que tem sido observado também para metabólitos de endofíticos isolados de plantas não medicinais, pode estar relacionado à proteção do hospedeiro contra microrganismos fitopatogênicos (GUNATILAKA et al., 2006). A ação antitumoral também tem sido detectada com freqüência.

Pelo exposto acima, fica evidente a importância do estudo de fungos endofíticos de plantas medicinais. Especialmente para o Brasil, detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta e de vasto conhecimento etnobotãnico, este é um campo estratégico a ser explorado, pois além de contribuir para o conhecimento e o domínio da biodiversidade brasileira no que tange à sua microbiota, apresenta enorme potencial de geração de novos produtos de uso terapêutico.

As pesquisas sobre microrganismos endofíticos no Brasil foram iniciadas no começo da década de 90, no Departamento de Genética da ESALQ/USP, pelo Prof. João Lucio de Azevedo, o qual é responsável pela formação de grande parte dos pesquisadores que atuam na área no país. O Diretório dos Grupos de Pesquisa no Brasil/Plataforma Lattes/CNPq aponta 27 grupos que desenvolvem pesquisas relacionadas a microrganismos endofíticos. Estudos voltados para substâncias bioativas com potencial terapêutico oriundas desses microrganismos são desenvolvidos na Universidade Federal do Amazonas, Universidade Federal de São Carlos, Universidade Estadual Paulista-Araraquara, Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ/RJ, Centro de Pesquisa René Rachou - FIOCRUZ/MG, Universidade Estadual de Ponta Grossa, Universidade Federal da Bahia, Universidade de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo-Ribeirão Preto, Universidade Federal do Pará e Universidade Federal Fluminense; entre outros. Por tratar-se de área relativamente recém implantada, essencialmente interdisciplinar, o desenvolvimento de novos produtos sem dúvida se beneficiará de colaborações entre especialistas nas áreas de microbiologia, processos microbianos, química de produtos naturais e farmacologia aplicada.

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