Proposta de formulação contendo extrato de folhas de Eugenia involucrata e análise da atividade antimicrobiana

Resumo

Eugenia involucrata, também conhecida como cerejeira-do-mato, é uma espécie nativa do sul do Brasil. O objetivo do trabalho foi otimizar um extrato das folhas de E. involucrata, empregando turbo-extração, e desenvolver uma emulsão, contendo o extrato, avaliando a atividade antimicrobiana. Para otimização do extrato foram avaliados dois fatores, determinando resíduo seco e teor de compostos fenólicos. Na elaboração da emulsão foi utilizado homogeneizador ultra turrax, e as concentrações do extrato adicionadas à emulsão foram de 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0%. As formulações foram avaliadas frente ao pH, características visuais, tamanho de partícula e polidispersão. Para o ensaio antimicrobiano foi aplicada técnica de difusão em ágar. Por meio do planejamento fatorial 32 do Centro de Pesquisa e Processamento de Alimentos - CEPPA, considerando os fatores polaridade do solvente e tempo de extração, foi possível verificar melhores resultados com o extrato obtido em solvente etanol e tempo de extração de 3 minutos. A formulação apresentou pH ácido, sem separação de fases, variações no tamanho de gotícula, indicando sistema com distribuição heterogênea e atividade antifúngica. O sistema emulsionado desenvolvido, contendo diferentes concentrações de extrato, apresentou atividade antifúngica em todas as concentrações testadas, indicando que novos estudos podem ser realizados para otimizar a formulação desenvolvida.

Palavras-chave:

Eugenia involucrata.

Cerejeira do mato.

Turbo-extração.

Emulsão.

Candida krusei.

Abstract

Eugenia involucrata, popularly known as cerejeira-do-mato, is a native specie of brazilian south. The aim was to optimize an extract from the leaves of E. involucrata, using turbo-extraction, and developed an emulsion evaluation antimicrobial activity. Two factors were determined, time and polarity of the solvent, determining the dry residue and phenolic compounds content. Ultra turrax homogenizer was used for preparation of the emulsion and the extract concentrations added were 0.5; 1.0; 1.5 and 2%. The formulations were evaluated for pH, visual characteristics, particle size and polydispersity. The microbiological assay agar diffusion technique was applied. Using the factorial design 32 of the Center for Research and Food Processing - CRFP, considering solvent polarity (hexane, dichloromethane and ethanol 70%) and extraction time (10, 20 and 30 minutes), was possible to verify the extract obtained of 3 minutes with the ethanol solvent was the better results. The formulation showed acidic pH, without phase separation, variations in droplet size, indicating system with heterogeneous distribution and antifungal activity. The emulsified system developed with different concentrations of extract showed antifungal activity in all the concentrations tested, indicating that new studies can be carried out to optimize the developed formulation.

Keywords:

Eugenia involucrata.

Cerejeira do mato.

Turbo-extraction.

Emulsion.

Candida krusei.

Introdução

A utilização de plantas para fins medicinais ocorre de forma abrangente e disseminada pela população, constituindo uma das mais antigas formas de tratamento,  seu uso muitas vezes corresponde como o único recurso terapêutico para algumas comunidades^(1-2).

A flora brasileira apresenta grande heterogeneidade, considerando o número e a variedade de espécies, como a família Myrtaceae, que apresenta espéciesnativas e exóticas^(3-4). Esta família abrange uma variedade de gêneros e espécies arbóreas, destaque especial ao gênero Eugenia, que apresenta valor econômico, devido à comercialização de seus frutos comestíveis e como planta ornamental⁽⁵⁾.

Estudos demonstram ainda, que esse gênero se destaca pelo potencial farmacológico⁽⁶⁾. Extratos das folhas de diferentes espécies do gênero Eugenia, e o óleo essencial extraído das folhas dessas, apresentaram atividades antibacteriana e antifúngica^(7,8,9), além disso, o extrato bruto do caule e folhas do gênero Eugenia apresentou atividade antioxidante⁽⁷⁾. Outras atividades descritas na literatura, a partir de estudos com extratos, foi atividade diurética e anti-inflamatória ^(10-11).

A espécie Eugenia involucrata DC.,conhecida popularmente como cerejeira do mato, é nativa da região Sul do Brasil. Possui valor econômico devido à qualidade de seus frutos, que podem ser consumidos in natura ou usados para confecção de doces, geleias, licores e são consumidos pela avifauna. A planta é indicada para plantação em áreas degradadas e ainda utilizada como planta ornamental. Folhas desta espécie são utilizadas na medicina popular, em forma de chás, com propriedades antidiarréica e digestiva⁽¹²⁾. Embora citada na literatura, e considerando a atividade antimicrobiana apresentada por outras espécies do gênero^{(9,13,14,15,16)}, poucas são as pesquisas dedicadas ao estudo da E. involucrata ^(17,12). O estudo fitoquímicodas folhas de E. involucrata ⁽¹⁶⁾ possibilitou o isolamento da -(-) catequina, do fitol, e das substâncias inéditas 24,25-epoxi-28-hidroxicicloartan-3-ona e 24,25-epoxi-28-hidroxi cicloartan-3-ona acetilado; ainda segundo o autor, foi possível observar, também, moderada atividade antimicrobiana e eficaz atividade antinociceptiva, relacionadas principalmente à substância isolada 24,25-epoxi-28-hidroxicicloartan-3-ona.

Assim, o objetivo do trabalho foi obter extratos otimizados de folhas de E. involucrata por turbo-extração, considerando polaridade dos solventes e tempo de extração, para avaliar a atividade antimicrobiana desses extratos, além de desenvolver emulsão, contendo o extrato otimizado, avaliando tamanho de partícula, índice de polidispersão e, também, atividade antimicrobiana da formulação.

Material e Métodos

Coleta e identificação do material vegetal

As folhas de Eugenia involucrata foram coletadas na época de pré floração, no mês de maio de 2016, no período da manhã, no município de Toledo/PR (S 24°43'34.529", W 53°44'41.189"). A identificação foi realizada pela bióloga Lilian Q. Cardoso, e a exsicata foi depositada no herbário central da Pontifícia Universidade Católica do Paraná - Campus Curitiba (HUCP 24563).

Preparação dos extratos

As folhas foram submetidas à secagem em estufa de circulação de ar, em temperatura de 40 °C por quatro dias; posteriormente foram moídas, em moinho de facas (TECNAL, TE-650), até obtenção de um pó fino. Os extratos foram obtidos pelo método de turbo-extração, utilizando solventes de polaridade distintas como etanol, diclorometano e hexano, na proporção 1:20 (pó vegetal: solvente), em tempos de extração de 1, 2 e 3 minutos. Após a extração, foi realizada filtração simples e os extratos foram armazenados em frascos de vidro âmbar.

Determinação de resíduo seco dos extratos

Foram retiradas alíquotas de 10 mL de cada extrato e transferidas para frascos de vidro âmbar, previamente dessecados. As amostras foram submetidas à secagem em estufa de circulação de ar a 40 °C por 24 horas, dessecador por 24 horas e posterior pesagem do resíduo seco. A análise de cada extrato foi realizada em triplicata.

Determinação de compostos fenólicos dos extratos

O teor de compostos fenólicos foi determinado pelo método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, conforme metodologia⁽¹⁸⁾. Foram preparadas soluções do padrão de ácido gálico nas concentrações de 20, 30, 40, 50, 60 e 70 μg/mL. Em tubos de ensaios foram adicionados 0,2 mL das soluções do padrão ou 0,2 mL dos extratos (1:20, p/v), sendo em seguida adicionados 1 mL do reagente de Folin-Ciocalteau e após dois minutos, adicionados 0,8 mL de carbonato de sódio (7,5 % p/v). A mistura foi incubada à temperatura de 24 °C por 1 hora e a leitura foi realizada em espectrofotômetro (FENTO, Cirrus 80), com comprimento de onda de 765 nm. Como branco, foi utilizada solução empregada na preparação da curva, sem adição do ácido gálico. A quantidade de compostos fenólicos de cada extrato foi quantificada por meio da curva padrão de ácido gálico. Todas as determinações foram feitas em triplicata.

Análise estatística

Para escolha do melhor extrato, considerando a determinação de resíduo seco e de compostos fenólicos totais, as análises estatísticas foram realizadas por meio de Excel 2007 e software Statistica®.

Preparação da emulsão

A emulsão foi preparada contendo 5% de núcleo oleoso. Para a formação da fase oleosa foi empregado o extrato otimizado, nas concentrações de 0,5; 1,0; 1,5 e 2%, ácido caprílico e 2% de monoestearato de sorbitan (span 60). A fase aquosa foi preparada com 2% de polissorbato 80 (tween 80) e água deionizada⁽¹⁹⁾. Inicialmente, as fases foram aquecidas separadamente e a fase aquosa vertida sobre a oleosa, com agitação a 6500 rpm, utilizando Ultra Turrax®T25 por 5 minutos. Ao final do processo, as formulações foram envasadas e acondicionadas em temperatura ambiente, ao abrigo da luz e denominadas F1, F2, F3 e F4, respectivamente (TABELA 1).

Foi preparada uma emulsão base, sem adição de extrato, composta de 5% de ácido caprílico, 2% span 60, 2% tween 80 e água deionizada, visando à comparação dos resultados obtidos. Foram preparadas 150 mL de cada uma das formulações.

Determinação de características organolépticas e pH

A análise das características visuais, cor e homogeneidade, e o pH foram realizadas no tempo inicial e após 30 dias de armazenamento em temperatura ambiente (25 ± 2 °C) ao abrigo de luz. Nesse período, as amostras foram dispostas em béqueres de vidro vedados com papel filme. O pH da emulsão, em suas diferentes concentrações de extrato, foi determinado diretamente com potenciômetro (Hanna HI 2222), previamente calibrado.

Determinação do tamanho de partícula e polidispersão (PDI)

A determinação de distribuição do tamanho de partícula e índice de polidispersão das formulações preparadas foi realizada pela técnica de dispersão de luz dinâmica (DLS) (Beckman Coulter DELSATMNano C, Califórnia). Para tanto, as amostras foram avaliadas após o preparo e a leitura foi realizada com diluição de 1:100 em água destilada.

Avaliação da atividade antimicrobiana

Após evaporação dos solventes, o material seco foi pesado, acrescido de três gotas de polissorbato 20 (Tween 20) e solução salina 0,9%, obtendo concentrações dos extratos de 1,5; 3,0; 6,0 e 12,0 mg/mL.

A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada em triplicata para todos os extratos, por meio do método de difusão em ágar⁽²⁰⁾. Foram empregadas cepas padronizadas de Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Salmonella typhimurium (NEWP 0028), Streptococcus pyogenes (NEWP 0015), Candida albicans (NEWP 0031), Candida krusei (ATCC 14243) e Candida tropicalis (NEWP 0133).

Após cultivo dos microrganismos, foram transferidas pequenas quantidades de cada cepa para cubetas de vidro, contendo solução salina 0,9%, até obtenção de suspensões microbiológicas com 25 ± 2% de transmitância, em fotocolorímetro (Micronal, B440) a 580 nm. A partir destas suspensões foram preparados os inoculos a 1%. Nas placas de Petri, para cepas bacterianas e fúngicas, foram adicionados 20 mL dos meios de cultura n° 1 e ágar Sabouraud-dextrose, respectivamente; e 5 mL dos inoculos a 1% nos respectivos meios de cultura. Após completa solidificação, os meios de cultura foram perfurados, com auxílio de perfurador estéril, formando 6 orifícios com diâmetro de 6 mm. Foram adicionados 20 µL de solução contendo os extratos em cada orifício. As placas foram incubadas a 35 ± 2 °C e 25 ± 2 °C, por 24 e 48 horas, para bactérias e fungos, respectivamente, sendo realizada posteriormente a determinação do tamanho dos halos de inibição formados.

Como padrões foram empregados antibióticos de amoxicilina 0,5 µg/µL e sulfato de neomicina 1,5 µg/µL, e para os fungos foram empregados cetoconazol e sulfeto de selênio nas concentrações de 1,5 µg/µL. Como controle negativo foi utilizado solução salina 0,9% contendo tween 20. Os resultados dos ensaios antimicrobianos foram expressos através do cálculo da média dos tamanhos dos halos de inibição formados.

Para a avaliação da atividade antimicrobiana da emulsão contendo o extrato otimizado, foram empregadas cepas padronizadas de C. krusei e S. aureus. Aos furos formados no meio de cultura, foram adicionados 20, 30 e 40 µL de cada uma das formulações preparadas, com pH previamente ajustado em 7,0, com auxílio de hidróxido de sódio (NaOH) 10%. As placas foram incubadas em estufa por 24 e 48 horas, a uma temperatura de 35 ± 2 °C e 25 ± 2 °C, para S. aureus e C. krusei, respectivamente. Após este período, os halos de inibição formados foram medidos. Os testes foram realizados em triplicata para todas as formulações e como controle negativo foi utilizada a emulsão base. A TABELA 2 demonstra as concentrações de extrato testadas em cada ensaio para as formulações desenvolvidas, considerando as quantidades de emulsão aplicadas em cada orifício.

Resultados e Discussão

A determinação de resíduo seco permite a visualização do potencial extrativo do método e do líquido extrator. Os índices de resíduo seco dos extratos apresentaram valores variáveis, entre 0,125% e 0,840%, considerando a polaridade e o tempo de extração, conforme demonstrado na TABELA 3.

Na FIGURA 1, obtida pelo software Statistica®, verifica-se que o aumento da polaridade do líquido extrator ocasionou maior teor de resíduo seco, de modo que o extrato etanólico, obtido com o tempo de extração de 3 minutos, apresentou maior potencial.

Observa-se uma correlação positiva em que, ao aumentar a polaridade e o tempo de extração, tem-se o aumento gradual de resíduo seco, sendo que os extratos que apresentaram maiores índices de resíduo seco foram àqueles obtidos com solventes polares. Podendo-se atribuir estes resultados, ao fato de que compostos presentes nas folhas de Eugenia involucrata possuem características polares. menor teor de resíduo seco apresentado em extratos obtidos com hexano⁽²¹⁾, deve-se à capacidade do mesmo em extrair maior quantidade de compostos apolares, enquanto o solvente diclorometano realiza extração de substâncias lipofílicas, óleos fixos, ceras e agliconas. O etanol por sua vez, é um solvente capaz de extrair grande quantidade de constituintes de interesse, pois, além de possuir ponto de ebulição favorável para posterior extração do solvente (78,3°C)^(22-23), apresenta caráter anfifílico, permitindo a extração de substâncias com características apolares e polares⁽²⁴⁾, dentre os quais podem ser citados ceras, agliconas, sesquiterpenos, fitosteróis, hidrocarbonetos não voláteis, hidrocarbonetos de baixa massa molecular, sais orgânicos, polissacarídeos e substâncias fenólicas (flavonoides, taninos, fenóis simples e ácidos fenólicos)^(25-23), fato que pode justificar o maior teor de compostos fenólicos totais no extrato etanólico.

Compostos fenólicos existem naturalmente, em uma grande variedade de alimentos de origem vegetal, e podem estar em maior concentração em algumas partes das plantas como frutas, flores, folhas e sementes ^(26-27). A determinação do teor de compostos fenólicos totais nos extratos, empregando reagente de Folin-Ciocalteau, que envolve redução do mesmo, pelos compostos fenólicos presentes nas amostras com formação de complexo azul, foi realizada por meio da equação da reta y=0,0102x+0,0117, obtida através da elaboração da curva de calibração do ácido gálico. A mesma apresentou coeficiente de correlação 0,9949 (FIGURA 2).

Conforme esperado, os extratos apolares demonstraram menor teor de compostos fenólicos, comparado com aqueles obtidos com solventes polares, conforme TABELA 4.

A quantificação dos compostos fenólicos demonstrou variações acentuadas nos valores de acordo com a polaridade do solvente utilizado. A maioria dos compostos fenólicos encontrados em Eugenia sp., apresenta solubilidade em água e em solventes orgânicos polares, em geral possuem características ácidas, sendo instáveis e facilmente oxidáveis⁽²⁸⁾.

Os compostos fenólicos exibem grande quantidade de propriedades fisiológicas, como antialergênica, antiarteriogênica, anti-inflamatória, antimicrobiana, antitrombótica, cardioprotetiva e vasodilatadora⁽²⁹⁾. Extratos de diversas espécies do gênero Eugenia demonstram concentrações elevadas de compostos fenólicos, sendo que extratos obtidos com etanol acidificado permitiram maior quantidade de extração destes compostos⁽³⁰⁾.

Conforme esperado a polaridade dos solventes empregados exerceu correlação positiva significativa (𝑃<0,05) na extração de compostos fenólicos (FIGURA 3), sendo mais acentuada em comparação ao tempo de extração. O extrato etanólico, obtido com tempo de extração de 3 minutos, apresentou maior teor de compostos fenólicos totais, demonstrando a eficiência do solvente, do tempo e do método extrativo na quantificação de compostos fenólicos.

Dentre as diversas propriedades atribuídas aos compostos fenólicos, ressalta-se o crescente interesse pelo potencial antimicrobiano. Estes compostos atuam diretamente sobre microrganismos, prejudicando a sobrevivência e a multiplicação⁽³¹⁾, porém não existem padrões sensatos para comparação de medicamentos com os extratos aplicados em ensaios microbiológicos⁽³²⁾. Os ensaios antimicrobianos, empregando os extratos desenvolvidos, demonstraram inibição das cepas de Staphylococcus aureus e Candida krusei nas concentrações de 3,0; 6,0 e 12,0 mg/mL (TABELA 5). Nas demais cepas testadas, os extratos não apresentaram inibição. Verificou-se que, ao aumentar as concentrações testadas, não houve aumento proporcional da atividade antimicrobiana.

Os padrões empregados nos ensaios antimicrobianos foram efetivos para os microrganismos utilizados, pois apresentaram formação de halos de inibição. O controle negativo, preparado com tween 20 e solução salina 0,9%, não apresentou atividade antimicrobiana, de modo a demonstrar que o uso deste tensoativo não apresenta interferência no ensaio microbiológico⁽³³⁾.

É possível observar que os extratos obtidos utilizando etanol como líquido extrator apresentaram atividade semelhante ao antibiótico sulfato de neomicina frente a S. aureus nas concentrações de 6 e 12 mg/mL. Além disso, o extrato etanólico obtido por turbo-extração durante 3 minutos apresentou atividade antifúngica semelhante ao Cetoconazol na concentração de 12 mg/mL, e semelhante (nas concentrações 3 e 6 mg/mL) ou superior (na concentração 12 mg/mL) ao antifúngico sulfato de selênio, demonstrando o potencial antimicrobiano do extrato.

Para o preparo da formulação, foi utilizado o extrato obtido em etanol com tempo de extração de 3 minutos, pois o mesmo apresentou resultado significativamente superior (P<0,05) frente à avaliação de resíduo seco e teor de compostos fenólicos em comparação aos demais extratos preparados, além de apresentar atividade antimicrobiana frente ao S. aureus e C. krusei. O extrato foi adicionado à formulação em diferentes concentrações e o pH da formulação, obtido no tempo inicial e em 30 dias de armazenamento, foi 3,0. Quanto à análise visual, as mesmas mantiveram-se estáveis, com coloração esverdeada, aspecto homogêneo e sem separação de fases.

A TABELA 6 apresenta os resultados do tamanho de gotícula e PDI das formulações desenvolvidas. Verifica-se que o método de agitação em ultra turrax acarretou a formação de emulsões com escala micrométrica.

A PDI é um parâmetro adimensional da amplitude do tamanho de gotícula, podendo variar de 0 a 1. Um valor de PDI próximo a 0, indica população de gotículas monodispersas, enquanto que PDI com valores mais elevados, indica ampla distribuição de tamanho de gotícula⁽³⁴⁾. Conforme demostrado na FIGURA 4, a emulsão, nas diferentes concentrações de extrato, possui elevada polidispersão, visto que os valores variaram de 0,87 a 1,32; portanto, mais próximos a 1,0, o que demonstra um sistema com distribuição heterogênea. Observa-se que ao aumentar a quantidade de extrato incorporado às formulações (1,5 e 2,0%), o sistema torna-se mais polidisperso, fato diretamente relacionado ao aumento da área superficial do núcleo oleoso, portanto as técnicas de preparo das emulsões e a composição qualitativa e quantitativa dos constituintes são os principais fatores que alteram a estrutura final das partículas⁽³⁵⁾.

As cepas padronizadas de C. krusei e S. aureus, foram utilizadas para a avaliação da atividade antimicrobiana da emulsão, seguindo como parâmetro os resultados obtidos nos estudos com os extratos. Considerando que, o controle negativo apresentou halos de inibição consideráveis para as cepas empregadas e que, ácidos graxos livres podem exercer atividade contra fungos e bactérias, sendo sua ação intensificada em valores de pH ácido⁽³⁶⁾, fez-se ajuste do pH das formulações, antes da aplicação das mesmas nas placas de Petri. Essa alteração de pH da formulação também conferiu à emulsão, um leve aumento na viscosidade.

Após ensaio antimicrobiano com as formulações contendo extrato, verificou-se que as preparações apresentaram atividade frente à C. krusei (TABELA 7) e que não foi possível verificar a presença de halos de inibição frente à bactéria, nas concentrações testadas. Da mesma forma, no estudo com os extratos etanólicos de folhas de E. involucrata, foram obtidos resultados positivos para a cepa C. krusei, demonstrando atividade inibitória em concentrações de 3, 6 e 12 mg/mL de extrato.

A formulação, contendo o extrato otimizado nas concentrações 0,5 e 1,0% permitiu o desenvolvimento de um sistema emulsionado em escala micrométrica, com PDIs inferiores as demais concentrações avaliadas (1,5 e 2,0%). É importante salientar que, apesar da concentração inferior (0,5%) de extrato na emulsão F1, a mesma apresentou atividade antimicrobiana, sendo o tamanho dos halos formados semelhantes aos obtidos nas demais concentrações do extrato. Mais estudos são necessários, entretanto a formulação F1, contendo 0,5% de extrato, mostra-se promissora para possível utilização no tratamento tópico de infecções cutâneas por C. krusei.

Considerações Finais

Com base no desenvolvimento do planejamento fatorial 32, o extrato de folhas de Eugenia involucrata, que melhor demonstrou eficácia nos parâmetros de determinação de resíduo seco e compostos fenólicos, foi o extrato obtido com o solvente etanol em tempo de extração de 3 minutos, empregando a turbo-extração. Os extratos apresentaram atividade antimicrobiana para Staphylococcus aureus e Candida krusei. As formulações, contendo diferentes concentrações de extrato, apresentaram-se com pH ácido e sem separação de fases e apresentaram atividade antifúngica para C. krusei, em todas as concentrações testadas.A elaboração de uma emulsão, contendo o extrato otimizado na concentração 0,5% permitiu o desenvolvimento de um sistema emulsionado polidisperso de escala micrométrica, com PDI 1,0, indicando um sistema de distribuição heterogênea, com atividade antifúngica satisfatória. Novos estudos devem ser realizados para otimizar a formulação desenvolvida, e verificando também a sua estabilidade físico-química.

Agradecimentos

À Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUC-PR), por todo suporte disponibilizado para o desenvolvimento do estudo. À Universidade Estadual de Maringá (UEM), pela disponibilização de equipamentos.

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