Perfil fitoquímico e avaliação da atividade antimicrobiana de extratos aquoso e etanólico de folhas de Cecropia pachystachya

Resumo

Cecropia pachystachya conhecida popularmente como embaúba é uma árvore nativa das Américas Central e do Sul, utilizada na medicina popular para tratamento de infecções respiratórias, hiperlipidemias e antidiabética. Apesar de sua utilização, poucos estudos de caracterização e avaliação de suas atividades biológicas e farmacológicas são encontrados. Este trabalho objetivou avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos aquoso e etanólico de folhas de C. pachystachya e realizar análise fitoquímica preliminar dos extratos. Folhas secas e trituradas foram utilizadas para o preparo do extrato aquoso por infusão, e etanólico por turbo-extração. A triagem fitoquímica foi realizada por técnicas colorimétricas e precipitação, e a quantificação de compostos fenólicos totais por Folin-Ciocalteau, demonstrando-se a presença de açúcares redutores, taninos, carboidratos em ambos os extratos, além de alcaloides e flavonoides no extrato aquoso, e saponinas e esteroides no extrato etanólico. A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada pela técnica de difusão em Ágar por perfusão. O teor das substâncias fenólicas foi de 13,29 e 35,83 mg/mL para os extratos aquoso e etanólico respectivamente. Somente o extrato etanólico demonstrou atividade frente a Staphylococcus aureus. A utilização de etanol como solvente extrator potencializou a obtenção de metabólitos fenólicos, permitindo observar a atividade antimicrobiana do extrato frente à S. aureus.

Palavras-chave:

Embaúba.

Plantas medicinais.

Atividade antibacteriana.

Staphylococcus aureus.

Triagem fitoquímica.

Abstract

Cecropia pachystachya, popularly known as "embaúba", is a tree native to Central and South America, used in folk medicine for treatment of respiratory infections, hyperlipidemia and antidiabetic. Despite its use, few studies of characterization and evaluation on its biological and pharmacological activities are available. Thus, the present work aimed to evaluate the antimicrobial activity of the aqueous and ethanolic extracts obtained from C. pachystachya leaves and to carry out preliminary phytochemical analysis of the extracts. Dried and crushed leaves were used for the preparation of the aqueous extract, by infusion, and ethanolic by vortical extraction. Phytochemical screening was performed by colorimetric and precipitation techniques, and the quantification of total phenolic compounds by Folin-Ciocalteau, demonstrating the presence of reducing sugars, tannins, carbohydrates in both extracts, as well as alkaloids and flavonoids in the aqueous extract, and saponins and steroids in the ethanolic extract. The evaluation of the antimicrobial activity in agar by perfusion. The content of phenolic compounds was 13.29 and 35.83 mg/mL for the aqueous and ethanolic extracts, respectively. Only the ethanolic extract showed activity against Staphylococcus aureus by diffusion technique. The use of ethanol as extracting solvent increased the phenolic compounds, allowing to observe the antimicrobial activity of the extract against S. aureus.

Keywords:

Embaúba.

Medicinal plants.

Antibacterial activity.

Staphylococcus aureus.

Phytochemical screening.

Introdução

A família Urticaceae apresenta aproximadamente 1200 espécies, distribuídas em cerca de 50 gêneros, dentre eles o gênero Cecropia, que compreende cerca de 100 espécies, encontradas na América Tropical. Uma das espécies pertencentes a este gênero é a Cecropia pachystachya Trec., conhecida popularmente como embaúva, embaúba, imbaúba, umbaúba, árvore da preguiça, e como toré na região do Cariri-Cearense⁽¹⁾. É uma árvore de rápido crescimento, higrófita, característica de solos úmidos, ocorrendo em matas ciliares, bordas de florestas e clareiras⁽²⁾, utilizada na medicina tradicional para o tratamento de infecções respiratórias⁽³⁾, hiperlipidemias⁽⁴⁾ e antidiabética⁽⁵⁾.

Pesquisas já investigaram e relataram as atividades: ansiolítica, antidepressiva, antioxidante, cardiotônica, sedativa e anti-inflamatória para extratos aquoso e alcoólico de C. pachystachya⁽¹⁾. Em estudos com ratos, o extrato metanólico de folhas de C. pachystachya apresentou uma significativa atividade hipotensiva⁽⁶⁾, enquanto o extrato hidroalcoólico demonstrou inibição do crescimento de Leishmania amazonensis⁽⁷⁾. Estas atividades farmacológicas podem estar relacionadas aos metabólitos encontrados em C. pachystachya^(6-7).

Estudos anteriores revelaram a presença de flavonoides como isovitexina, orientina, isoorientina⁽⁸⁾, catequina, proantocianidinas⁽⁹⁾, alcaloides, cardenolídeos, saponinas, glicosídios cardiotônicos e taninos em extratos da espécie em questão. As catequinas, procianidinas, flavonoides e ácido clorogênico, podem estar diretamente relacionados com as atividades cardiovascular, respiratória, gastrointestinal e sobre o sistema nervoso central⁽⁷⁾. Sabe-se que plantas que apresentam elevados teores de substâncias fenólicos apresentam diversas propriedades farmacológicas tais como: anti-alergênicas, anti-arteriogênicas, anti-inflamatórias, antimicrobianas, antitrombóticas, antioxidantes, antitumoral e efeitos cardioprotetores e vasodilatadores^(10,11,12). Tal potencial farmacológico incentiva as pesquisas com C. pachystachya, uma vez que a investigação da constituição química da espécie é fundamental para a associação entre os compostos bioativos nela presentes e suas respectivas propriedades farmacológicas.

Staphylococcus aureus habita principalmente a mucosa naso-faríngea em humanos e animais, fazendo parte da microbiota normal, porem relacionada a casos de surtos de toxinose⁽¹³⁾. Além disso, S. aureus é um dos principais microrganismos que causam infecções cutâneas e doenças invasivas, como endocardite, pneumonia e osteomielite. Já foram isoladas diversas amostras de S. aureus resistentes a uma ampla variedade de agentes antimicrobianos como β-lactama, penicilinas e cefalosporinas⁽¹⁴⁾. Devido ao aumento do desenvolvimento da resistência aos medicamentos, a pesquisa de novos compostos antimicrobianos tem sido o foco de uma série de estudos, dessa forma, diversos extratos de plantas medicinais vêm sendo estudadas por serem consideradas fontes promissoras de compostos bioativos⁽¹⁵⁾.

Tão importante quanto à elucidação do perfil químico e a atividade biológica, é a escolha do método extrativo apropriado. A escolha de um método extrativo deve levar em consideração a seletividade dos componentes de interesse, recuperação do analito, volume do solvente orgânico, toxicidade do solvente, tempo de extração e custo⁽¹⁶⁾. O solvente extrator constitui um fator importante e deve ser avaliado em função da quantidade e dos metabólitos presentes na amostra⁽¹⁷⁾.

Visto que diferentes solventes apresentam seletividade diferenciada, resultados biológicos desiguais podem ser observados para um mesmo material vegetal quando exposto a solventes distintos. Assim, este estudo buscou realizar a análise fitoquímica preliminar e avaliação antimicrobiana dos extratos aquoso e etanólico obtidos de folhas de C. pachystachya frente a cepas catalogadas de S. aureus (ATCC 25922), Escherichia coli (ATCC 25923), Salmonella typhimurium (NEWT 0028) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).

Material e Métodos

Coleta do material vegetal

Folhas de Cecropia pachystachya foram coletadas em fase de pré-floração, em agosto de 2016, no município de Toledo – PR, Brasil, situado nas coordenadas geográficas: 24º 43'40 40" S e 53º 46'01 68" W. A identificação botânica da planta foi realizada pelo herbário da Universidade Estadual do Oeste do Paraná (exsicata nº: 3000).

Preparo dos extratos

As folhas foram secas em estufa de ar circulante a 40ºC durante 7 dias, trituradas em moinho de facas até obtenção de um pó fino, e em seguida conservadas em recipiente fechado e ao abrigo da luz.

O extrato aquoso foi preparado por infusão seguida de maceração em água destilada a 100ºC (1:10, p/v), que posteriormente foi reservado por 24 horas em recipiente fechado. Passado esse período, o infuso foi filtrado, congelado e liofilizado (LIO TOP, Brasil).

O extrato etanólico foi preparado por turbo de extração (METALÚRGICA SIEMSEN, Brasil), durante 15 minutos, utilizando-se como solvente etanol 96ºGL (BIOTEC, Brasil). Posteriormente o extrato foi filtrado e levado em evaporador rotativo (FISATOM, Brasil) a 40ºC, a fim de eliminar todo o solvente orgânico presente. O resíduo foi congelado e liofilizado.

Caracterização físico-química e fitoquímica preliminar

A partir dos extratos liofilizados foi realizada a triagem fitoquímica para avaliação da presença de açúcares redutores, alcaloides, antraquinona, carboidratos, esteroides, flavonoides, glicosídeos, saponinas e taninos pelos métodos de precipitação e coloração⁽¹⁸⁾. O pH foi determinado à 20ºC através de um potenciômetro calibrado (GEHAKA, Brasil), e a avaliação do total de extrativos foi realizada pelo método de resíduo seco.

Quantificação de compostos fenólicos totais

A quantificação de compostos fenólicos totais foi realizada pelo método de Folin-Ciocalteu ⁽¹⁹⁾, em espectrofotômetro a 750 nm (FEMTO CIRRUS 80, China). A curva de calibração foi realizada em triplicata, para cinco concentrações de ácido gálico em metanol (de 15,625 a 250 μg/mL), obtendo-se a equação da reta y= 0,0011x + 0,016, em que "x" representa a concentração de ácido gálico em µg/mL, e "y" a absorbância. A reta apresentou coeficiente de correlação R²=0,996.

Posteriormente, cada extrato foi preparado e quantificado. Todos os testes foram realizados em triplicata. Os resultados foram expressos em miligramas equivalentes a ácido gálico por mililitro de extrato (mg EAG/mL).

Avaliação da atividade antimicrobiana

A determinação da atividade antimicrobiana foi realizada em triplicata, pela técnica de difusão em ágar por perfusão (técnica de poços) ⁽²⁰⁾, utilizando suspensões padronizadas, na concentração de 25% de transmitância (absorbância de 580nm), de Staphylococcus aureus (ATCC 25922), Escherichia coli (ATCC 25923), Salmonella typhimurium (NEWT 0028) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), inoculadas à 1% em ágar Mueller Hinton ⁽²¹⁾. Após o resfriamento, foram perfurados em cada placa cinco orifícios de 6 mm de diâmetro, impregnados com 20 µL dos extratos aquoso e etanólico, nas concentrações de 100 mg/mL ⁽²²⁾, controle negativo (solução salina) e controle positivo (Amoxicilina e Sulfato de Neomicina, 10 mg/mL). As placas foram acondicionadas em estufa bacteriológica (37±2ºC) por 48 horas. Após incubação foi realizada a leitura dos diâmetros dos halos de inibição (mm) com o auxílio de um paquímetro.

Resultados e Discussão

Neste estudo dois extratos foram preparados empregando solventes de diferentes polaridades e, posteriormente, avaliados quanto ao teor de extrativos e de substâncias fenólicas totais, bem como quanto à atividade antimicrobiana, pela técnica de difusão em ágar por perfusão.

Os resultados encontrados permitem observar o diferente potencial extrativo dos solventes etanol e água sobre folhas de C. pachystachya (TABELA 1). Diversos estudos vêm demonstrando a influência do solvente extrator sobre o teor de metabólitos secundários ^(23,24,25).

A extração de determinadas substâncias também pode ser interferida pelo pH do liquido extrator. Para escolha do solvente ideal deve levar em consideração a sua toxidez, riscos, a disponibilidade e o custo do solvente. O método extrativo e o solvente extrator estão diretamente relacionados ao rendimento do extrato final, e também aos metabólitos extraídos. Dessa forma é preciso levar em consideração o que se deseja extrair, pois muitas substâncias são termossensíveis, enquanto outras podem sofrer modificações estruturais irreversíveis em altas temperaturas⁽²⁶⁾.

O etanol é um solvente capaz de extrair uma grande quantidade de constituintes de interesse, pois além do seu ponto de ebulição (78,3°C) ser favorável a posterior extração do solvente^(7,27), apresenta caráter anfifílico, permitindo a extração tanto de substâncias com características apolares quanto polares⁽²⁶⁾. Esse fato que pode justificar o maior teor de substâncias fenólicas no extrato etanólico.

A água é bastante utilizada como solvente extrator, pois apresenta diversas características interessantes, como a baixa toxidez, além disso, é conhecida por extrair substâncias com potencial atividade antimicrobiana, como os flavonoides⁽²⁸⁾. Além de apresentar vantagens relacionadas a aspectos econômicos e ambientais. Extratos aquosos já demonstraram alta seletividade, comportamento justificado pela polaridade, hidrofobicidade (não interage com substâncias polares) e capacidade de formação de micelas⁽²⁹⁾. Esta seletividade pode explicar o menor teor de extrativos encontrado para o extrato aquoso.

A triagem fitoquímica demonstrou a presença de açúcares redutores, taninos, carboidratos em ambos os extratos, além da presença de flavonoides e alcaloides no extrato aquoso, e, saponinas e esteroides no extrato etanólico (TABELA 2).

Dentre os metabolitos secundários encontrados neste estudo destaca-se a presença de flavonoides, taninos, alcaloides e saponinas, corroborando com estudos anteriores^(7,9), e com os descritos para espécies pertencentes ao gênero Cecropia⁽³⁰⁾.

Embora a atividade farmacológica observada por um determinado extrato seja normalmente resultado do efeito sinérgico e conjugado, alguns metabólitos presentes nos extratos vegetais podem responder majoritariamente pela atividade biológica⁽³¹⁾. Portanto, é importante destacar suas principais propriedades biológicas e farmacológicas para as classes de metabólitos encontradas neste estudo.

Os flavonoides são conhecidos por apresentarem diversas atividades biológicas, agem como antioxidantes na inativação dos radicais livres⁽³²⁾, e destacam-se quanto a capacidade de agir sobre a inflamação e sobre o sistema imunológico, fornecendo um enorme potencial farmacológico⁽³³⁾. Plantas que contém flavonoides apresentam significativa atividade antimicrobiana⁽³⁴⁾, a qual pode estar associada à sua solubilidade e a atribuição de grupos fenólicos hidroxilo, que apresentam afinidade com proteínas, atuando como inibidores de enzimas bacterianas, assim como intervindo em suas vias de síntese⁽³⁵⁾.

As atividades biológicas dos taninos estão relacionadas, principalmente, com sua propriedade adstringente⁽³⁶⁾. Os taninos demonstram importantes ações antimicrobianas e antifúngicas, além de serem utilizados no tratamento de diarreia, hipertensão arterial, reumatismos, hemorragias, feridas, queimaduras, problemas renais, problemas estomacais, além de processos infecciosos⁽³⁷⁾. A presença de compostos tânicos em C. pachystachya já foi relatada⁽³¹⁾. Estas substâncias são altamente reativos quimicamente, capazes de formar pontes de hidrogênio intra e intermoleculares, originando complexos insolúveis em água com alcaloides, gelatina e outras proteínas, nas quais se embasam os principais testes de detecção, bem como a atividade antimicrobiana do metabólito⁽³⁸⁾.

Diversos alcaloides são utilizados como venenos e alucinógenos, conhecidos pela sua ação sobre o sistema nervoso central⁽³⁹⁾. A presença de alcaloides pode ser relacionada a uma ampla gama de atividades biológicas investigadas. Muitos alcaloides indólicos agem nos sistemas neurotransmissores opiáceos, GABAérgicos, colinérgicos muscarínicos, serotoninérgicos e dopaminérgicos, por isso são utilizados como hipotensores, simpatolíticos, diuréticos, vasoconstritores periféricos, estimulantes respiratórios, anestésicos, agentes bloqueadores adrenérgicos, espasmogênicos intestinais, sedativos, relaxantes musculares e como antimicrobianos^(37,40).

As saponinas são metabólitos que apresentam propriedades detergentes e surfactantes. No organismo sofrem complexação com sais biliares e colesterol no trato gastrointestinal, impedindo sua completa absorção, além de possuírem ação antifúngica⁽⁴¹⁾, e ação citotóxica atuando contra células tumorais⁽⁴²⁾.

Apesar dos metabólitos encontrados em ambos os extratos apresentarem destacada atividade antimicrobiana, o extrato aquoso não apresentou atividade frente às cepas avaliadas na concentração e condição empregada. Todavia, o extrato etanólico apresentou uma pequena atividade frente à S. aureus (TABELA 3).

O método de difusão em ágar pode sofrer influência de algumas variações como: composição do meio de cultura, presença de enzimas, densidade do inoculo, difusibilidade do extrato no meio de cultura, assim é possível que a baixa polaridade dos compostos diminua a velocidade de difusão destes no ágar, gerando um halo de difusão, proporcionalmente, menor em relação a substâncias mais polares⁽⁴³⁾. Assim, apesar da alta concentração de substâncias fenólicas presente nos extratos, outros interferentes podem ter influenciado no potencial antimicrobiano, levando a ausência e a pequena atividade frente às cepas e condições avaliadas.

Conclusão

Neste trabalho foi possível demonstrar a grande variabilidade de metabólitos secundários presentes em folhas de Cecropia pachystachya. Diferenças quanto ao potencial extrativo dos solventes empregados também foram evidenciadas, fato que influenciou diretamente nos teores de fenólicos totais e na inibição do crescimento microbiano sobre S. aureus.

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