Efeitos alelopáticos de extratos vegetais de Hancornia speciosa Gomes, na germinação de Lactuca sativa L.

Resumo

Hancornia speciosa Gomes (Apocynaceae) é uma fruteira, conhecida como mangabeira, com ampla distribuição no Brasil e muito utilizada na medicina popular, por suas propriedades anti-inflamatórias, anti-hipertensivas, antidiabéticas e antimicrobianas. Entretanto, nenhum estudo foi realizado com objetivo de avaliar o potencial alelopático dessa espécie. Nesse sentido, esse estudo objetivou investigar a atividade alelopática de H. speciosa, a partir do extrato aquoso de folhas secas sobre a germinação de sementes de Lactuca sativa L. O experimento foi conduzido no município de Porto Nacional, Tocantins, Brasil, no período de agosto/2015 a julho/2016. Folhas de mangabeira coletadas em três áreas de Cerrado foram trituradas, até obter-se um pó que posteriormente foi diluído em água destilada, resultando no extrato aquoso com concentrações de 10%, 7,5%, 5,0%, e 2,5% m/v, sendo a água destilada utilizada como testemunha. Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado, após a análise do delineamento, nos efeitos dose, local e interação dose versus local, os graus de liberdade de dose foram desdobrados em polinômios ortogonais. Pode-se verificar que o extrato aquoso de folhas de H. speciosa apresentou efeito alelopático negativo sobre as sementes de L. sativa, pois retardou a germinabilidade e aumentou o tempo médio de germinação, enquanto que o índice de sincronia não foi fortemente influenciado.

Palavras-chave:

Mangabeira.

Hancornia speciosa.

Atividade alelopática.

Padrões vegetacionais.

Cerrado.

Abstract

Hancornia speciosa Gomes (Apocynaceae) is a fruit tree known as mangabeira with wide distribution in Brazil and widely used in folk medicine, due to its anti-inflammatory, antihypertensive, antidiabetic and antimicrobial properties. However, no study was carried out to evaluate the allelopathic potential of this species. In this sense, this study aimed to investigate the allelopathic activity of H. speciosa, from the aqueous extract of dry leaves on the germination of Lactuca sativa L. The experiment was carried out in the municipality of Porto Nacional, Tocantins, Brazil, from August/2015 to July/2016. Mangabeira leaves collected in three Cerrado areas were ground until a powder was obtained which was later diluted in distilled water, resulting in the aqueous extract with concentrations of 10%, 7.5%, 5.0%, and 2.5% m/v, the distilled water being used as a control. A completely randomized design was used, after analysis of the design, dose, site and dose-local interaction, dose degrees of freedom were deployed in orthogonal polynomials. It can be verified that the aqueous extract of leaves of H. speciosa presented a negative allelopathic effect on the seeds of L. sativa, as it delayed the germinability and increased the average time of germination, whereas the synchrony index was not strongly influenced.

Keywords:

Mangabeira.

Hancornia speciosa.

Allelopathic activity.

Vegetative patterns.

Cerrado.

Introdução

Alelopatia é definida como uma interferência química, que uma planta (incluindo microrganismos) exerce sobre outra, podendo provocar efeito direto ou indireto, benéfico ou danoso ⁽¹⁾. É um importante mecanismo ecológico, pois atua estimulando ou suprimindo o desenvolvimento e o crescimento de outras plantas, influenciando na dominância, sucessão das plantas, formação de comunidades, vegetação clímax, manejo e produtividade de culturas ^(2,3).

Compostos químicos que participam da atividade alelopática dos vegetais são denominados de aleloquímicos, provêm do metabolismo secundário e estão relacionados a mecanismos de defesa das plantas, contra ataques de microrganismos e insetos, que vêm sendo adquiridos ao longo de um processo de evolução ^(4,5). Os aleloquímicos estão presentes em todos os tecidos das plantas e sua produção pode ser regulada por diversos fatores ambientais, como temperatura, intensidade luminosa, disponibilidade de água e nutrientes ^(6,7), e são liberados no meio ambiente por meio da lixiviação foliar, decomposição de resíduos vegetais, volatilização, exsudação radicular e incorporação dos compostos no solo ⁽⁸⁾. Quando liberados no ambiente podem ser absorvidos por outras plantas, influenciando no processo de germinação, crescimento e desenvolvimento por ações em processos fisiológicos ^(9,10).

Diversos aleloquímicos podem ser utilizados como herbicidas naturais, em substituição aos compostos sintéticos de uso corrente na agricultura, com destaque para os alcaloides, benzoxazinonas, derivados do ácido cinâmico, coumarinas e compostos cianogênicos ^(11,12,13). Além disso, os aleloquímicos são uma importante fonte de novos medicamentos, haja vista que compostos fenólicos e flavonoides possuem propriedades antioxidantes, antimicrobianas e citotóxicas ^(14,15). Dessa forma, pesquisas no âmbito da alelopatia podem ser uma alternativa interessante e viável para obtenção de novas substâncias que venham atender às necessidades atuais e futuras da medicina, agricultura, farmacologia e meio ambiente, reduzindo ou eliminando a contaminação, preservando os recursos naturais e garantindo o oferecimento de produtos com qualidade ^(16,17).

Nesse contexto, o Cerrado surge como uma área relevante para estudos alelopáticos, uma vez que é a savana tropical mais rica do planeta, com mais de 12.000 espécies de plantas ⁽¹⁸⁾ e uma área prioritária para a conservação em nível global, devido a sua elevada biodiversidade e crescente taxa de conversão dos seus ambientes naturais provocados principalmente pela agricultura ⁽¹⁹⁾. No entanto, em uma revisão sobre bioatividade de plantas do Cerrado, observou-se que apenas 0,61% haviam sido estudadas ⁽²⁰⁾. Apesar dos poucos estudos desenvolvidos do ponto de vista fitoquímico, a maioria encontrou efeitos alelopáticos significativos, sugerindo que a alelopatia desempenha um papel importante na ecologia do Cerrado ^(20,21,22).

Dentre as diversas espécies do Cerrado, a mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) é uma fruteira pertencente à família Apocynaceae, nativa do Brasil e está presente nas regiões Centro-Oeste, Sudeste, Norte e Nordeste. Planta perenifólia de clima tropical, seus frutos possuem aroma e sabor agradável, e a frutificação ocorre entre outubro e dezembro ⁽²³⁾, sendo muito utilizada pela agroindústria do Nordeste. Seus frutos podem ser consumidos in natura ou processados na forma de sorvete, suco, geleia, doces e licor ⁽²⁴⁾. Além de ser conhecida pelo seu uso culinário, a H. speciosa é amplamente reconhecida pelas suas propriedades bioativas, demonstrando atividade anti-hipertensiva, antidiabética, anti-obesidade, antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatória, citotóxica, gastroprotetora, vasodilatadora e cicatrizante ^(25-36). Entretanto, nenhum estudo foi realizado com objetivo de avaliar o efeito alelopático dessa espécie. Nesse sentido surge a necessidade de estudos basais que contemplem o potencial alelopático dessa espécie. No presente estudo avaliou-se o efeito alelopático exercido pelo extrato aquoso de folhas de H. speciosa sobre a germinação de sementes de Lactuca sativa L.

Material e Métodos

O estudo foi conduzido no município de Porto Nacional, região central do Estado do Tocantins, entre agosto/2015 e julho/2016. Para obtenção do extrato, foi realizada a coleta de folhas de H. speciosa em três áreas independentes de Cerrado: na fazenda Canaã (10°40'17,6''S 48°20'53''W), Providência (10°33'25,15"S; 48°24'45,84"W) e São Judas Tadeu (10º48'09''S e 48º25'28''W) para averiguar a existência de influência local no comportamento alelopático do extrato da H. speciosa (FIGURA 1). As exsicatas encontram-se depositadas no herbário do Tocantins, sob registro HUEFS n° 237031. O clima da região é definido como tropical de classificação climática de Köppen e Geiger como sendo de savana com chuva de verão (Aw). Apresenta temperatura média de 26,1°C (variando 3,0°C durante o ano), sendo o mês de setembro o mais quente (27,9°C de temperatura média) e julho o mais frio (24,9°C). A pluviosidade anual média de 1622 mm, com o mês mais seco (junho) com uma média de quatro mm, e o mais chuvoso (março) com 262 mm ⁽³⁷⁾.

No mês de coleta foram realizadas análises físico-químicas do solo e determinação da clorofila a e clorofila b, segundo metodologia própria ^(38,39). Os dados meteorológicos foram obtidos pela estação meteorológica do município de Porto Nacional - TO e fornecido pelo Instituto Nacional de Meteorologia ⁽⁴⁰⁾.

A preparação do extrato realizou-se seguindo uma metodologia adaptada ⁽⁴¹⁾, utilizada nos bioensaios de germinação. Folhas de H. speciosa sadias foram retiradas de forma assistemática, de dez matrizes pré-selecionadas de cada área. As folhas foram secas em estufa a 45°C durante período de 60 horas ou até peso constante, trituradas separadamente obtendo-se um pó, posteriormente agrupado numa única amostra por local e disperso em água destilada na proporção de 100 g para 1 L para resultar no extrato aquoso bruto (10% m/v).

O uso de extrato aquoso é recomendado em estudos alelopáticos porque reflete mais de perto o que aconteceria sob condições naturais ⁽¹⁰⁾. O extrato bruto foi filtrado com auxílio de uma bomba elétrica de vácuo acoplada a um Kitassato com funil de Buchner, coberto com uma camada de papel de filtro qualitativo. O extrato resultante foi recolhido em um béquer e a partir do extrato bruto foram realizadas as diluições de 10%, 7,5%, 5,0% e 2,5% m/v, sendo a água destilada utilizada como testemunha, resultando em cinco tratamentos.

Para o bioensaio de germinação a espécie escolhida como receptora foi L. sativa (alface), pois apresenta maior sensibilidade aos efeitos de aleloquímicos, é resistente a uma ampla faixa de pH e é considerada indicadora de atividade alelopática, sendo frequentemente usada em testes de laboratório ^(41,42,43). As sementes de L. sativa (Grand Rapids TBR), com 82% de germinação e pureza de 99,0% foram adquiridas no comércio local. Adotaram-se quatro repetições de 50 sementes por placa de Petri contendo duas folhas de papel filtro embebidas em 10 mL de água destilada ou extrato correspondente. Todo material experimental foi previamente autoclavado e, durante a manipulação dos materiais, as mãos e as bancadas passaram por um processo de assepsia com o uso de etanol 70%. A semeadura ocorreu em capela de fluxo contínuo a fim de evitar contaminações. O experimento foi conduzido em câmara de germinação com fotoperíodo de 12 horas e temperatura controlada a 25°C.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3 x 5 (três locais: Canaã, Providência, São Judas Tadeu, e cinco concentrações:  0% (controle), 2,5%, 5,0%, 7,5% e 10,0%).  As contagens dos diásporos germinados foram realizadas a cada 12 horas e, após o sétimo dia de experimento, o intervalo de contagem passou a ser de 24 horas até a estabilização da germinação, sendo este o intervalo mais recomendado para bioensaios de germinação. Adotou-se a protrusão de qualquer parte do embrião como critério de germinação ⁽⁴²⁾.

Os dados obtidos foram submetidos aos cálculos de (i) germinabilidade (G) que corresponde a porcentagem de sementes em que o processo de germinação chega ao final, por meio do crescimento intraminal que resulta na protrusão (ou emergência) de um embrião vivo ^(44,45); (ii) tempo médio de germinação (T) que é a média ponderada do tempo que cada semente levou para germinar ^(44,45); e o (iii) índice de sincronia (I) proposto para medir a sincronização de sementes, detectando o número de vezes em que as sementes germinam independente de quando isso ocorre, onde valores próximos de 1 representam que a germinação de todas as sementes ocorre ao mesmo tempo e valores próximos de 0 quando pelo menos duas sementes podem germinar, uma de cada vez ^(44,45). Além disso, os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), sendo o efeito de doses desdobrado em contrastes ortogonais. Para a obtenção dos pressupostos da análise de variância foi realizado o teste de homogeneidade de Hartley e normalidade de Shapiro-Wilk; os dados foram transformados para análise, sendo a porcentagem de germinação transformada em arco seno da raiz quadrada de x/100 ^(46,47) e por Box-Cox para as variáveis, tempo médio e índice de sincronização.

Resultados e Discussões

Os resultados obtidos mostraram que não houve diferença significativa no efeito alelopático entre os locais analisados e na interação dose versus local, pois todos os p-valores foram maiores que 0,05 (TABELA 1) indicando que, independentemente de onde foram coletadas as folhas de H. speciosa, o efeito alelopático no experimento foi igual.

Segundo a literatura ^(1,48), fatores abióticos tais com radiação solar, nutrientes minerais, temperatura e estresse hídrico, podem ser utilizados como parâmetros para indicar diferenças nas biossínteses de compostos aleloquímicos. Portanto, esses fatores, desconsiderando os fatores bióticos e antrópicos, principalmente herbívora e queimadas, podem promover variações genéticas em populações naturais e resistência perante as pressões ambientais, sendo o fator preponderante para a seleção natural. Assim, as plantas que ocorrem em um gradiente ambiental podem variar quanto à constituição genética e atividade fisiológica, embora pertencendo a mesma espécie, e podem responder de modo muito diferente às tensões ambientais. Entretanto, as análises preliminares de solo e clorofila não demonstraram diferenças significativas entre os locais, os fatores de nutrientes minerais e a radiação solar. Também, pelo fato dos acessos estarem na região central do Estado do Tocantins, convergem para as mesmas condições de umidade e temperatura. Além disso, pode-se considerar o descarte de fatores genéticos, pois a H. speciosa é planta endêmica do Cerrado, e todos os acessos foram realizados com indivíduos endêmicos em locais que não possuem diferenças latitudinais. Estes fatos corroboram para uma explicação plausível com os resultados em não haver diferença significativa no efeito alelopático entre os locais analisados.

Nesse estudo os parâmetros analisados indicam efeitos alelopáticos inibitórios significativos no processo de germinação de L. sativa em função das concentrações de extrato aquoso de folhas secas de H. speciosa testado (p < 0,05). Ao analisar a germinabilidade das sementes de L. sativa, foi observado um decréscimo linear significativo na porcentagem de germinação com o aumento na concentração do extrato (FIGURA 2A). Logo, os efeitos mais expressivos da inibição ocorreram na concentração de 10% (m/v), germinando apenas 18% das sementes. Observou-se, ainda, que à medida que a concentração do extrato se tornava mais diluída a porcentagem de germinação aumentava gradativamente, chegando a 71% de germinação quando a concentração do extrato era de 0% (m/v). Assim, a cada aumento de 1% na concentração do extrato houve uma redução de 5,23% no processo de germinação. Com frequência, em estudos alelopáticos, a germinabilidade é um índice muito utilizado, embora na maioria das vezes não demonstra um resultado expressivo. O que mais se observa são efeitos significativos de extratos sobre o tempo médio e velocidade de germinação e nenhuma diferença na germinabilidade em relação ao controle ^(42,49,50). No entanto, nesse estudo foram identificados resultados relevantes no processo de germinabilidade. As mudanças nesse parâmetro podem ser apenas fatores secundários decorrentes de interações que ocorrem em níveis celulares e moleculares, pois os aleloquímicos podem alterar estruturas citológicas, hormonais, as membranas e sua permeabilidade, a absorção de minerais, transcrição e tradução do DNA, respiração, conformação de enzimas e receptores entre outros ^(10,51).

O tempo médio de germinação também apresentou uma variação linear e significativa (FIGURA 2B), nesse caso havendo um acréscimo do tempo médio de germinação com respeito à concentração do extrato. Quando as sementes estavam embebidas no controle o tempo médio para a germinação foi de 86 horas, enquanto que para a concentração de 10,0% o tempo médio para a germinação das sementes foi 193 horas. Ou seja, a cada 1% de aumento na dose do extrato houve um aumento de aproximadamente 10 horas no tempo médio de germinação, levando a conclusão que o extrato induziu atraso na emergência do embrião das sementes de L. sativa. Dessa forma, corrobora com a ideia de que os aleloquímicos promovem efeitos prejudiciais no processo de germinação e crescimento, reduzindo a porcentagem de sementes germinadas, atrasando a germinação que muitas vezes impossibilitam a continuidade de seu desenvolvimento ^(44,52).

Resultados semelhantes foram encontrados ao testar o efeito alelopático do fruto de Sapindus saponaria na germinação de L. sativa, verificando que o extrato aquoso exerceu efeito significativo sobre o processo de germinação. Houve decréscimo linear na porcentagem de germinação, na velocidade média de germinação e na velocidade de germinação. Por outro lado, houve aumento linear no tempo médio de germinação ⁽⁴¹⁾. Em bioensaios realizados com extratos foliares das espécies Peltophorum dubium e Psychotria leiocarpa, igualmente constataram que os extratos causaram atraso na germinação dos aquênios L. sativa, o que foi visualizado nas alterações do tempo médio de germinação ⁽⁵³⁾, assim como observado em nossos estudos.

Nos bioensaios de atividade alelopática com extrato aquoso de Araucaria angustifolia na germinação de L. sativa, observou-se um decréscimo linear nos valores de porcentagem de germinação, ocasionando inibição em torno de 80% da germinação das sementes nas concentrações de 5,0% e 7,5% (m/v), o que pode ser explicado pela presença de componentes aleloquímicos ⁽⁵⁴⁾.

Em um estudo de atividade alelopática com onze espécies nativas do Cerrado sobre a germinação de L. sativa e Sesamum indicum, observou-se que todos os extratos aquosos a 10% (m/v) atrasaram a germinação das espécies receptoras, sendo Davilla elliptica, Diospyros hispida, Kielmeyera coriacea, Miconia albicans, Piptocarpha rotundifolia e Schefflera vinosa as espécies que demonstraram maiores efeitos alelopáticos ⁽⁵⁵⁾. Esse resultado apoia a hipótese de que, sob condições de estresse abiótico e biótico, pode ocorrer um aumento na atividade alelopática das plantas ⁽⁵⁶⁾. No caso específico do Cerrado, podemos considerar o estresse hídrico, ao qual o solo deste domínio é submetido durante a estação seca ou o fogo, outro elemento característico, que ao danificar as plantas induz a produção de aleloquímicos ^(57,58). O aumento da produção de aleloquímicos pode proporcionar uma maior inibição nas plantas concorrentes / receptoras e caracterizar um importante mecanismo de defesa da planta ⁽⁵⁹⁾. Esse resultado favorece a ideia de que a atividade alelopática é um mecanismo fundamental nas interações ecológicas do Cerrado ⁽²¹⁾.

O atraso na germinação pode significar uma desvantagem para as sementes em campo, pois estas ficarão expostas por mais tempo a patógenos como fungos, fatores ambientais e predação. Outra desvantagem é que sementes que demoram a germinar irão competir com plantas já pré-estabelecidas em crescimento ⁽⁶⁰⁾. Esse fator tem um significado ecológico, pois plantas que germinam mais lentamente podem apresentar tamanho reduzido ⁽⁶¹⁾ e, consequentemente, podem ser mais suscetíveis a estresses ambientais e terem menor chance na competição por recursos ⁽²¹⁾.

Além da germinabilidade e do tempo médio de germinação o índice de sincronia é um parâmetro que demonstra o nível de organização ou desordem das reações químicas no processo de germinação ^(10,46). Na interpretação do índice de sincronização, quanto menor for o seu valor mais sincronizado será a germinação, independentemente do número total de sementes germinadas ⁽⁴⁶⁾. No presente estudo o maior valor para o índice de sincronização correspondeu a aproximadamente 3,7% de concentração do extrato, decaindo com o aumento da mesma (FIGURA 2C). A perda da sincronia de germinação representa heterogeneidade na fisiologia dos aquênios de L. sativa ⁽⁴⁵⁾, autenticando que a ação dos aleloquímicos interfere no padrão de sincronia da germinação de sementes submetidas a tais compostos ⁽⁴³⁾. Resultados semelhantes também foram encontrados em bioensaios de germinação com extrato aquoso de Persea americana Mill. sobre L. sativa pois as sementes mostraram-se mais sincrônicas nas concentrações mais baixas do extrato ⁽⁶²⁾.  O comportamento do número total de sementes germinadas em cada concentração do extrato no decorrer das horas está representado graficamente e corrobora para os resultados anteriormente relatados (FIGURA 2D).

Os efeitos alelopáticos resultam da ação de várias substâncias que atuam em conjunto, visto que, em geral, os aleloquímicos são encontrados em baixas concentrações no meio ambiente ^(59,63-65). Além disso, extratos vegetais são misturas que podem conter substâncias de várias classes como terpenos, compostos fenólicos, flavonoides, taninos, alcaloides, aminoácidos não proteicos, dentre outras, compostos que estão envolvidos nos efeitos alelopáticos de inibição de metabolismo das plantas alvo e, que apresentam efeitos complexos sobre as espécies testadas. Assim sendo, análises químicas mais detalhadas são necessárias para esclarecer quais desses compostos seriam os responsáveis pelo efeito alelopático ⁽⁶⁰⁾.

Os ensaios de fitotoxicidade podem ser utilizados para direcionar o isolamento e a identificação dos compostos responsáveis por esta atividade ^(6,65). No entanto, para comprovar que o extrato aquoso de folhas secas de H. speciosa apresenta efeito alelopático e testar seu uso potencial como agente químico natural, sugerimos outras abordagens experimentais para uma maior compreensão dos resultados obtidos. Estudos a campo devem ser realizados para confirmar se este potencial alelopático, como processo inibitório, se expressa em condições naturais.

Conclusão

Os ensaios de atividade alelopática realizados com extrato aquoso de folhas secas de Hancornia speciosa sobre a germinação de Lactuca sativa indicam que não houve diferença de locais de coletas no efeito alelopático do extrato. Porém, o mesmo apresentou efeito alelopático negativo sobre as sementes de L. sativa, pois retardou significativamente a germinabilidade, ao passo que houve acréscimo considerável no tempo médio de germinação, enquanto que o índice de sincronia não foi fortemente influenciado. Conclui-se que houve um retardo no processo de germinação das sementes de L. sativa sob o efeito do extrato aquoso de H. speciosa, em laboratório.

Futuros estudos de análises fitoquímicas são promissores para o entendimento e identificação das substâncias alelopáticas, além da determinação das porcentagens de concentração destas nos acessos estudados.

Agradecimentos

Os autores agradecem o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento e Tecnológico (CNPq) pela bolsa de estudo acadêmico (PIBIC) e a Fundação Universidade Federal do Tocantins (UFT).

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