Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante do óleo essencial de Aniba parviflora (Meisn) Mez.

Resumo

Os óleos essenciais de Aniba parviflora (Meisn) Mez. (Lauraceae) foram avaliados quanto a sua constituição química, atividade antimicrobiana e antioxidante. Os óleos essenciais (OE) de folhas e galhos de A. parviflora mostraram-se ativos contra cepas patogênicas de Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis, apresentando halos de inibição de 13 e 9 mm, respectivamente. A partir da técnica de microdiluição em caldo, os OE apresentaram uma Concentração Inibitória Mínima (CIM) de 2,0 mg/mL para ambas as bactérias, S. aureus e E. faecalis. Quanto à atividade antioxidante, os óleos essenciais de folhas e galhos não mostraram capacidade de redução do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). Através da análise por cromatografia gasosa, acoplada a espectrometria de massa (CG-EM), foram identificadas 74 substâncias nos OE de A. parviflora, das quais o monoterpeno linalol foi o composto majoritário de ambos os óleos.

Palavras-chave:

Aniba parviflora (Meisn) Mez.

Óleos essenciais.

Macacaporanga.

Antimicrobiano.

Antioxidante.

Linalol.

Abstract

The essential oils of Aniba parviflora (Meisn) Mez. (Lauraceae) were evaluated for chemical composition, antimicrobial activity and antioxidant. The essential oils (EO) from leaf and branch of A. parviflora were active against pathogenic strains of Staphylococcus aureus and Enterococcus faecalis. It has presented respectively 13 and 9 mm of inhibition halos. Using the broth microdilution, the EO presented a minimum inhibitory concentration (MIC) of 2.0 mg/mL for both bacteria, S. aureus and E. faecalis. Regarding its antioxidant activity, the essential oils from leaf and branch has shown no ability to reduce the free radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Using gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), 74 compounds were identified in the essential oils of leaves and branches of A. parviflora, in which the monoterpene linalool was the major compound in both oils.

Keywords:

Aniba parviflora (Meisn) Mez.

Essential oils.

Macacaporanga.

Antimicrobial.

Antioxidant.

Linalol.

Introdução

Aniba parviflora (Meisn) Mez. (Lauraceae), popularmente conhecida como macacaporanga ou louro rosa, e que tem como sinonímia Aniba fragrans,é uma planta aromática, característica de solos argilosos e não inundáveis, sendo frequentemente encontrada na Bacia Amazônica e nas Guianas^[1]. Na região Amazônica, ramos e madeira de A. parviflora, quando secos, são transformados em pó e utilizados como sachês aromatizantes^[2].

A casca, as folhas e a casca interna da sinonímia de A. parviflora são usadas na Amazônia no preparo de chás (decocção e infusão), tinturas e cataplasmas para tratar vítimas de envenenamento ofídico^[3]. Dados da literatura mostraram que extratos de A. fragrans apresentam potencial inibidor contra o veneno da Bothrops atrox. A avaliação das propriedades antiofídicas seguindo o preparo de modo similar ao utilizado na medicina popular, mostrou a eficácia dos extratos quanto a atividade anti-hemorrágica quando administrados por via oral.  Também foi observado que esses extratos apresentaram alto potencial antimicrobiano contra microrganismos envolvidos em infecções secundárias de acidentes ofídicos^[4].

Assim como trabalhos publicados com a sinonímia A. fragrans, atividades biológicas já foram descritas para A. parviflora. O óleo essencial de macacaporanga mostrou atividade antioxidante^[5], antidepressiva^[6] e antimicrobiana^[5,7] e boa atividade antiproliferativa contra linhagem de células MCF-7 de tumor de mama^[5]. Além disso, apresentou-se eficaz como indutor anestésico e sedativo para o transporte de tambaqui (Colossoma macropomum)^[8].

Muitos medicamentos em uso atualmente possuem origem natural ou foram projetados a partir de modelos de produtos naturais^[9]. Estudos para avaliar óleos essenciais obtidos de folhas de A. parviflora indicaram a presença do linalol como metabólito majoritário, entre outros terpenos^[7]. Substâncias de origem natural, incluindo o linalol, descritos na composição química de espécies do gênero Aniba, têm sido promissores na pesquisa para o desenvolvimento de medicamentos anti-infecciosos e antibacterianos.

Sabe-se que as infecções bacterianas constituem uma importante causa de morte no mundo, resultando em enormes prejuízos, tanto econômicos quanto sociais^[10]. Somado a isso está o desenvolvimento de mecanismos de resistência das bactérias aos antibióticos disponíveis, causado principalmente pelo aumento do uso de antimicrobianos, por vezes de modo indiscriminado e inapropriado^[11]. Como consequência, as doenças infecciosas tornam-se de difícil tratamento, aumentando a morbidade e mortalidade^[12]. Nesta perspectiva, a busca por novos antimicrobianos tem se intensificado em todo o mundo a fim de obter produtos alternativos que atuem por mecanismos de ação diferentes das drogas em uso comercial^[13].

O monoterpeno linalol, um dos principais constituintes do óleo essencial de A. parviflora, possui atividade antioxidante^[14]. O estresse oxidativo está associado ao desenvolvimento de doenças inflamatórias, cardiovasculares e câncer. Embora as substâncias fenólicas e os flavonóides estejam associados com a maioria dos antioxidantes naturais^[15], muitas outras substâncias estão sendo descobertas com esta propriedade. Nesse sentido, o propósito do presente estudo foi avaliar o potencial antimicrobiano e antioxidante do óleo essencial de folhas e galhos de Aniba parviflora (Meisn) Mez., coletados na região Amazônica, bem como determinar sua composição química.

Material e Método

Coleta do Material vegetal

Folhas e galhos de A. parviflora (macacaporanga) foram coletados de espécimes cultivados na fazenda Experimental Curauá-PEMATEC, localizada no município de Santarém, Estado do Pará, Brasil, sob as seguintes coordenadas geográficas: 2º33'45.68S e 54º37'00.37W. As amostras foram coletadas no período chuvoso e as exsicatas foram depositadas no herbário do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus, Brasil, sob o número de registro 254.490.

Obtenção do óleo essencial

O óleo essencial foi obtido por hidrodestilação em aparelho tipo Clevenger. Neste processo, o material vegetal foi submerso em água destilada na proporção de 1:10, e aquecido em temperatura de 100 °C por um tempo de três horas para folhas e de seis horas, para galhos. Após a extração, o óleo essencial obtido foi transferido para frascos de vidro âmbar e armazenados no freezer a baixa temperatura para posteriores ensaios de atividade biológica.

Análises por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM)

A composição química dos óleos essenciais de A. parviflora foi avaliada por Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM) utilizando cromatógrafo gasoso marca Shimadzu, modelo GCMS-QP2010, equipado com coluna capilar 5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm). Para a realização das análises cromatográficas, foi utilizado injetor Split ajustado à 220 ºC; coluna fixada em 60 ºC, com rampa de aquecimento de 3 ºC/min e temperatura final de 240 ºC. A temperatura do detector de espectro de massas foi fixada em 250 ºC. Hélio foi utilizado como gás de arraste a 1,0 mL/min.

O preparo das amostras para a análise cromatográfica deu-se pela solubilização dos óleos (folhas e galhos) em acetato de etila, na concentração de 20 mg/mL. Para a análise, foram injetadas duplicatas da solução, em volume de 1,0 μL por amostra. Os componentes dos óleos essenciais foram identificados por comparação com os dados descritos na literatura e os perfis da biblioteca de espectros de massa NIST 05.

Microrganismos e preparo do Inóculo

Para avaliação da atividade antimicrobiana dos OE, foram utilizadas cepas adquiridas comercialmente na forma liofilizada (Cefar, São Paulo, Brazil). Os microrganismos foram: Staphylococcus aureus (ATCC-25923) Enterococcus faecalis (CCCD-E002), Escherichia coli (CCCD-E004), Pseudomonas aeruginosa (CCCD-P004) e Candida albicans (ATCC 10231).

As estirpes bacterianas foram reativadas em Caldo de Infusão Cérebro e Coração (BHIB – Himedia) e incubadas a 37 ºC durante 24 h. C. albicans foi reativada em caldo Sabouraund dextrose, com incubação de 48 h à 28 ºC. Colônias em crescimento foram retiradas da cultura em placa e diluídas em solução salina, para obtenção de inóculos no padrão de turbidez do tubo 0,5 da escala de Mac Farland, que equivale à concentração final de 1,5 x 10⁸ UFC/mL para bactérias e 2 a 5 x 10⁶ UFC/mL para leveduras^[16].

Teste Qualitativo de Atividade Antimicrobiana - Difusão em Ágar

Os microrganismos foram inoculados em câmara de fluxo laminar, onde para cada 25 mL de meio de cultura foram adicionados 500 µL de inóculo padrão. Após a solidificação do ágar, foram feitas cavidades circulares de 6 mm de diâmetro em pontos equidistantes das placas, nos quais foram adicionados 20 µL da amostra (óleo essencial diluído em Tween 80 a 1%), na concentração de 4,0 mg/mL. Gentamicina (10 µg) e Cetoconazol (100 mg) foram utilizados como controles positivos para bactérias e leveduras respectivamente, soluções de Tween 80 foram utilizadas como controles dos diluentes. As placas foram incubadas em temperatura de 37ºC por 24 h para bactérias e 28ºC por 48 h para a levedura. Após a incubação, foi verificada a formação dos halos de inibição de crescimento. Os ensaios foram realizados em triplicata^[17].

Microdiluição em Caldo - Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

A CIM foi determinada somente para as amostras que apresentaram eficácia no método de difusão em poço (halos de inibição com diâmetro maior ou igual a 8 mm). A turbidez dos inóculos foi inicialmente padronizada frente ao tubo 0,5 da escala de McFarland, seguida de diluição em Caldo Mueller Hinton (MHC – Himedia) para atingir a concentração final de 1,5 x 10⁴ UFC/mL. Os ensaios foram realizados em triplicata, por adição de 100 μL de meio de cultura líquido, contendo o inóculo microbiano, e 100 µL das amostras de OE em concentrações variando entre 4 e 0,06 mg/ mL. Gentamicina foi utilizada como controle positivo. Adicionalmente foram realizados ensaios para controle de crescimento de microrganismos e controle de esterilidade do meio. As microplacas foram incubadas a 36 ºC durante 24 horas para posterior verificação do crescimento microbiano. A inibição do crescimento de bactérias foi revelada após adição de solução aquosa de resazurina (20 µL, 0,01%, p/v) e reincubação durante 3 h. A CIM foi revelada pela concentração mais baixa que promoveu a inibição do crescimento, evidenciada pela permanência da cor original. Os ensaios foram realizados de acordo com a norma M7-A6 do Manual Clinical and Laboratory Standards Institute^[18].

Sequestro do Radical livre DPPH

A atividade antioxidante do óleo essencial de folhas e galhos de A. parviflora foi determinada pelo método do sequestro do radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH). Para o preparo das soluções estoque foram pesados 0,0128 g do óleo essencial, e solubilizados em metanol P.A., avolumando-se para 10 mL em balão volumétrico. A partir da solução estoque foram feitas diluições sucessivas utilizando como solvente metanol P.A., até a concentração de 5,0 mg/mL. O ácido ascórbico, utilizado como antioxidante padrão, foi preparado nas concentrações finais de 200, 175, 150, 125, 100, 75 e 50 mg/mL para a construção da curva padrão. A solução de DPPH foi preparada na concentração 0,06 mol/L. Para a realização da análise antioxidante foram transferidos 50 µL de cada concentração da amostra em triplicata, para tubos de ensaio sendo adicionados 1950 µL da solução de DPPH. Decorridos 30, 60 e 120 minutos, leu-se a absorbância das amostras de A. parviflora e de ácido ascórbico em espectrofotômetro a 517 nm para posterior determinação da porcentagem de inibição de DPPH^[19].

Análise Estatística

Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as diferenças entre as médias foram determinadas pelo teste de Tukey (p≤0,05). Foram consideradas diferenças com p ≤ 0,05 como significativas. O nível de confiança foi estabelecido em 95%.

Resultados e Discussão

Análise Química dos Óleos Essenciais de Aniba parviflora

O rendimento médio dos óleos essenciais de folhas e galhos de A. parviflora, obtidos por hidrodestilação, foi de 0,52% e 0,34%, respectivamente. Estes resultados estão de acordo com o rendimento de OE de partes aéreas de A. parviflora, onde foi encontrado resultado de 0,5%^[7].

A partir da análise por CG-EM, 74 substâncias foram identificadas nos óleos essenciais de folhas e galhos de A. parviflora, com base em seus espectros de massas e tempos de retenção (TR). Nos óleos essenciais de folhas foram identificadas 51 substâncias e nos de galhos 44 (TABELA 1). O linalol correspondeu ao componente majoritário em ambos os óleos (22,8% para folhas e 11,90% para galhos). Dentre os principais componentes encontrados nos OE de folhas destacam-se os sesquiterpenos cariofileno (8,15%) e β-felandreno (7,55%), enquanto nos ganhos detectou-se a presença de aristoleno (11,07%) e β-eudesmol (3,97%).

Foram encontrados na literatura cinco trabalhos relatando a composição química dos óleos essenciais de A. parviflora. Dois trabalhos encontrados detiveram-se apenas a descrever o linalol como principal constituinte da espécie Aniba fragrans Ducke, a sinonímia botânica de A. parviflora^[20,21]. Em outro trabalho A. parviflora foi utilizada para avaliar o método de cromatografia em fase gasosa bidimensional abrangente para identificação dos seus componentes voláteis, sendo identificados 87 picos similares aos encontrados nos demais trabalhos, no entanto sem evidenciar quais os componentes majoritários. Os autores destacaram que o método GC x GC-qMS, desenvolvido na presente pesquisa, mostrou-se como uma alternativa bastante adequada na avaliação de óleos essenciais, com grande melhora em termos de separação e número de picos identificados^[22].

Sarrazin et al.^[7] descreveram a composição química de partes aéreas da espécie, sendo observado que das 51 substâncias identificadas, os componentes principais do óleo essencial de espécimes de A. parviflora coletadas entre o período de julho a novembro foram: o linalol (45,5%), β-felandreno (17,3%), α-felandreno (4,1%) e (E)-cariofileno (3,9%)^[7]. Em outro estudo foi descrita a composição química dos óleos essenciais de A. parviflora (folhas e galhos separadamente), identificando também 51 substâncias voláteis, onde os principais metabólitos nas folhas foram o β-felandreno (15,1%), o linalol (14,1%) e o β-eudesmol (12,9%) e nos ramos altas concentrações de β-eudesmol (16,8%), β-cariofileno (15,4%), linalol (12,4%), β-felandreno (6,7%) e biciclogermacreno (6,0%)^[5].

Importante ressaltar que nos dois últimos estudos, os espécimes de A. parviflora foram coletados em locais diferentes.Em relação ao monoterpeno linalol como componente majoritário, todos os trabalhos citados possuem o mesmo achado, porém com concentrações diferentes. Ressalta-se que as condições ambientais dos espécimes utilizados, em relação ao período sazonal, eram diferentes, o que pode ter influenciado na composição química do óleo^[23].

Atividade Antimicrobiana de Aniba parviflora

O óleo essencial de folhas e galhos de A. parviflora testados apresentaram atividade antimicrobiana, com formação de halos de inibição de 11,0 e 9,0 mm, para as bactérias Gram-positivas avaliadas Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis, respectivamente (TABELA 2). As demais cepas testadas não foram inibidas pelo OE de A. parviflora. Em estudos prévios para avaliar a atividade antimicrobiana de A. parviflora, Sarrazin et al.^[7] mostraram que o óleo essencial de partes aéreas foi eficaz contra os microrganismos Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis e Streptococcus pyogenes com halos de inibição variando entre 8,5 e 15,4 mm diâmetro. Silva et al.^[5] observaram que os óleos essenciais de folhas e galhos separadamente apresentaram atividade substancial contra Escherichia coli.

Fatores como o período de coleta, por exemplo, devem ser levados em consideração, uma vez que, no período seco a planta tende a sofrer mais injúrias pelas condições ambientais, podendo produzir uma maior quantidade de substâncias que possam defendê-la de tais estressores, garantindo sua sobrevivência, e levando à produção de metabólitos com grande potencial biológico, entre eles o antibacteriano^[23].

Em trabalhos que avaliaram a atividade de OE sobre bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, foi sugerido que a relativa impermeabilidade da membrana externa, rica em lipopolissacarídeos, presente em Gram-negativas e responsáveis pelo caráter hidrofílico da superfície dessas bactérias, dificulta a ação de substâncias hidrofóbicas e assim pode torná-las menos sensíveis aos OE^[24,25].

Os terpenos têm a capacidade de romper e penetrar na estrutura lipídica da parede celular das bactérias, levando à desnaturação de proteínas e da membrana celular e ao extravasamento do citoplasma e lise celular^[24,26].  Outras substâncias presentes nos óleos essenciais de A. parviflora também podem ter participado no efeito antimicrobiano, inclusive com interações sinérgicas entre eles.

Após a avaliação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de A. parviflora por difusão em ágar, foi realizado o ensaio quantitativo para a determinação da CIM. Os resultados mostraram que os óleos essenciais com resultados positivos no primeiro teste, foram capazes de inibir o crescimento bacteriano até a concentração de 2,0 mg/mL para os microrganismos testados. Os antimicrobianos podem ser classificados de acordo com a CIM: inibidores potentes (CIM até 0,5 mg/mL); inibidores moderados (CIM entre 0,6 e 1,5 mg/mL) e inibidores fracos (CIM acima de 1,6 mg/mL). Portando, os óleos essenciais de A. parviflora avaliados neste estudo são considerados inibidores fracos^[27]. É importante considerar que os óleos essenciais são uma mistura de substâncias voláteis e que os constituintes isolados poderiam favorecer uma menor CIM.

Os principais compostos do óleo essencial de A. parviflora (linalol, β-felandreno, cariofileno e β-eudesmol) já foram relatados como agentes antibacterianos. OE de Stachys lavandulifolia rica em β-felandreno e OE de Aquilaria crassna rica em cariofileno apresentaram atividade antimicrobiana contra S. aureus, P. aeruginosa e Candida sp.^[28,29]. O composto β-eudesmol foi majoritário do OE de Litsea kostermansii que apresentou atividade antibacteriana contra S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, Candida albicans e Aspergillus niger^[30]. Já o composto Linalol, possui atividades antibacterianas descritas tanto como composto majoritário de OE, como nas espécies Aniba roseadora, com atividade antibacteriana sobre S. aureaus, S. faecalis, S. epidermidis, E. coli e Klebsiella pneumoniae^[7] e na espécie Coriandrum sativumi com efeitos contra S. aureus, P. aeruginosa, E. coli e C. albicans^[31], quanto do monoterpeno isolado contra S. aureus e P. aeruginosa^[32].

Atividade Antioxidante dos Óleos Essenciais de Aniba parviflora

Os resultados de atividade antioxidante dos óleos essenciais de folhas e galhos de A. parviflora foram expressos em percentual de inibição e comparados com a atividade do ácido ascórbico, utilizado como padrão. Os resultados mostram que os óleos essenciais de A. parviflora não apresentaram potencial antioxidante frente ao radical livre DPPH, na concentração e tempo de reação, avaliados quando comparados ao antioxidante de referência. Em outro trabalho, avaliando atividade antioxidante dos OEs de folhas e galhos de A. parviflora também pelo método DPPH, e utilizando antioxidante padrão Trolox, um derivado de vitamina E, foi observada atividade antioxidante após 2 h de reação, sendo a cinética das reações considerada lenta pelos autores (acima de 60 min)^[5].

Os compostos majoritários do OE de A. parviflora, (β-felandreno, linalol, β-cariofileno) têm sido relatados como agentes antioxidantes. OE de Stachys lavandulifolia, rica em β-felandreno, apresentou alta atividade de eliminação de radicais DPPH^[28], assim como o OE de Salvia sclareoides, que possui o Linalol e o cariofileno como constituintes majoritários, apresentou boa atividade antioxidante no ensaio DPPH^[33]. O monoterpeno Linalol, principal constituinte do OE de A. parviflora, já foi avaliado a partir do composto isolado quanto a atividade antioxidante, pelos métodos DPPH e Peróxido de Hidrogênio, e apresentou bons resultados quando comparados ao antioxidante padrão^[34]. A atividade antioxidante dos terpenos pode ser atribuída à presença de ligações duplas conjugadas, por um mecanismo de quebra de cadeia, para a remoção de radicais livres^[35]. Dessa forma, é importante a escolha de outros métodos para avaliar a atividade antioxidante dos óleos essenciais, tendo em vista que estes não apresentaram percentual de inibição significativo.

Conclusão

Os óleos essenciais obtidos de folhas e galhos de Aniba parviflora coletados no período chuvosoapresentaram o linalol como composto majoritário, o qual pode ser o responsável pela atividade contra bactérias aqui observada. Os óleos essenciais de folhas e galhos não apresentaram atividade antioxidante apreciável. Os resultados indicam a potencialidade do emprego de Aniba parviflora por meio da utilização de seus óleos essenciais, visando o desenvolvimento de formulações com ativos naturais.

Agradecimentos

À CAPES pela concessão da Bolsa de Mestrado, à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas pela concessão de Bolsa de Incentivo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Tecnológico e ao CNPq pelo apoio financeiro (Projeto Bionorte número 554307/2010-3).

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