Potencial antioxidante e atividade antimicrobiana do extrato hidroetanólico de Ervatamia coronaria (Apocynaceae)

Resumo

O uso de plantas medicinais é uma prática da medicina popular realizada desde a antiguidade. Ervatamia coronaria é um arbusto nativo da Índia da família Apocynaceae. A crepe-jasmine como é conhecida popularmente, é utilizada como larvicida, laxativa e proteolítica. A pesquisa teve como objetivo avaliar o potencial antioxidante e a atividade antimicrobiana do extrato hidroetanólico a 70% das folhas de E. coronaria. Os testes foram realizados no Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Medicina Estácio de Juazeiro do Norte. O teor de fenólicos foi determinado pelo método de Folin-Ciocalteu, onde apresentou 26,15± 1,82 mg de equivalente de ácido gálico/g de extrato seco. O potencial antioxidante foi realizado pelo método do radical 1,1- difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), onde o extrato apresentou CI₅₀ 32,80± 1,10 µg/mL. A atividade antimicrobiana foi determinada pelo método de microdiluição em caldo, frente as cepas bacterianas Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Salmonella enterica (ATCC 14028) e Staphylococcus aureus (ATCC 6538), onde a Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi ≥ 1024 µg/ mL, apresentando-se clinicamente irrelevante nas concentrações testadas. Dessa forma, este extrato pode vir a ser um candidato a se tornar um fitomedicamento antioxidante, mas não um antibacteriano de origem natural.

Palavras-chave:

Plantas medicinais.

Ervatamia coronária.

Apocynaceae.

Antioxidantes.

Antimicrobiano.

Abstract

The use of medicinal plants is a folk medicine practice performed since ancient times. Ervatamia coronaria is a shrub, native to India, in the Apocynaceae family. Crepe-jasmine as it is popularly known is used as larvicide, laxative and proteolytic. The research aimed to evaluate the antioxidant potential and antimicrobial activity of hydroethanolic extract at 70% of E. coronaria leaves. The tests were performed at the Microbiology Laboratory of the Estadio de Juazeiro do Norte Medical School. The phenolic content was determined by the Folin-Ciocalteu method, where it presented 26.15 ± 1.82 mg gallic acid equivalent / g of dry extract. The antioxidant potential was realized by the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine (DPPH) radical method, where the extract showed IC 50 32.80 ± 1.10 µg / mL. Antimicrobial activity was determined by the broth microdilution method against the bacterial strains Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Salmonella enterica (ATCC 14028) and Staphylococcus aureus (ATCC 6538), where the Minimum Inhibitory Concentration (ATCC 6538) MIC) was ≥ 1024 µg/mL and was clinically irrelevant at the concentrations tested. Thus, this extract may turn out to be a candidate for becoming an antioxidant phytomedicine, but not a naturally occurring antibacterial.

Keywords:

Medicinal plant.

Ervatamia coronary.

Apocynaceae.

Antioxidants.

Antimicrobial.

Introdução

A população mundial carrega conhecimentos vastos sobre o ambiente que vivencia. Neste contexto, a diversidade vegetal contribui para o conhecimento relativo do uso de plantas medicinais, promovendo ações profiláticas e tratamento curativo frente várias enfermidades que acometem a espécie humana. Geralmente estas plantas medicinais usadas como tratamento inicial, é o único recurso terapêutico disponível em muitas comunidades^[1].

A Organização Mundial da Saúde estima que 60 a 85% da população faz uso de plantas medicinais como primeira escolha aos cuidados da saúde^[2]. O uso de plantas medicinais no Brasil é uma das práticas mais empregadas com a finalidade de cura, tratamento ou prevenção a enfermidades que acometem a sociedade^[3].

Neste enquadre situacional, a região nordeste brasileira é dotada de uma rica biodiversidade, com variação de espécies e peculiaridades biológicas. É importante salientar que o Cariri está localizado na região metropolitana do estado do Ceará, onde abriga um dos maiores pólos ecológicos do país. Sendo assim, referência de diversidade no ecossistema, por possuir ampla vegetação de finalidade terapêutica. As plantas medicinais mais encontradas na região do Cariri são a sucupira, barbatimão, aroeira, alfavaca, pequi, copaíba, macaúba, boldo, malva-do-reino, mastruz, quiabo e a crepe-jasmine^[4].

A Ervatamia coronaria, conhecida popularmente como crepe-jasmine, é um arbusto nativo da Índia pertencente à família Apocynaceae, muito usada em jardins com finalidade ornamental, suas flores exalam perfume característico além de belas formas, o que favorece para tal uso. É uma planta que possui entre os seus constituintes químicos alcalóides, flavonas, triterpenos, esteroides, fenilpropanóides, saponinas, taninos e fenóis. Seus metabólitos secundários têm comprovada atividade farmacológica para tratamentos como antiepilépticos^[5]. Além de apresentar atividade proteolítica^[6], catalítica, larvicida^[7], laxativo, citotóxica^[8] e antioxidante^[9].

Os antioxidantes por sua vez, são espécies químicas que atuam retardando as reações oxidativas, inibindo a formação de radicais livres e a complexação de metais. O desenvolvimento de novos produtos com ação antioxidante favorece a atividade protetiva celular e auxiliam no tratamento de diversas doenças^[10]. Estudos registram atividade antioxidante de Ervatamia coronaria, assim como mostra uma correlação do provável potencial antioxidante favorável. Porém os estudos literários indicam poucas informações sobre a eficácia terapêutica frente a atividade antimicrobiana.

A resistência bacteriana nos últimos anos tornou-se uma preocupação mundial^[11]. Diante desse fenômeno é necessário o desenvolvimento de antibióticos afim de melhorar o arsenal terapêutico disponível^[12].  Os produtos naturais constituem uma fonte importante para a prospecção de novas moléculas^[13].

Nesse contexto o presente estudo investiga o potencial antioxidante e a atividade antimicrobiana do extrato hidroetanólico de Ervatamia coronaria.

Material e Método

Coleta da planta

A espécie Crepe-jasmine foi coletada no dia 26 de fevereiro de 2018, às 15:30 hs, no bairro Muriti, na cidade do Crato, no interior do estado do Ceará, localizado na região nordeste do Brasil, apresentando coordenadas geográficas de latitude 07° 14' 03" S, longitude 30° 24' 34" W, altitude 426 m. Depositada para registro de exsicata no Herbário Caririense Dárdano de Andrade Lima (HCDAL), da Universidade Regional do Cariri (URCA), Departamento de Ciências Biológicas, na cidade do Crato-CE. Apresentando registro de número 13.490, a planta de nome popular Crepe-jasmine da família Apocynaceaede nome científico Ervatamia coronaria.

Obtenção do extrato hidroetanólico

As folhas verdes de Crepe-jasmine, foram maceradas em gral e pistilo, usado 112,43 g das folhas, acrescentando 1.200ml de álcool etílico a 70%, extraído por 48 horas, a filtração foi desempenhada com uso de Erlenmeyer, funil e algodão. A rotaevaporação realizada através de um evaporador rotativo 220V, da marca Quimis ISO 9001, modelo 0344B2/ 220V/ 1000W, número de série 15020772, a temperatura da rotaevaporação foi de 76°C, agitação 5rpm. O processo da rotaevaporação foi realizado por 8 horas, obtendo 5,30 g do extrato bruto e seco, com rendimento final de 4,71%.

Determinação do teor de fenólicos totais

O teor de compostos fenólicos totais do extrato de Ervatamia coronaria foi determinado usando o reagente de Folin-Ciocalteu de acordo com o método de Slinkard e Singleton^[14] com pequenas modificações, usando o ácido gálico como composto fenólico padrão. Para o ensaio, foram colocados em eppendorf, 100 μL da amostra (concentração final 100 μg/mL), 820 μL de água destilada e 20 μL do reagente de Folin-Ciocalteu homogeneizando com agitação durante 1 min. Em seguida foi adicionado 60 μL de uma solução de carbonato de sódio a 15%. A mistura foi agitada e permaneceu em repouso durante 2 horas, protegida da luz. Após o período de reação, uma alíquota da mistura (300 μL) foi transferida para placa de 96 poços e a absorbância foi detectada a 760 nm contra um branco (água destilada). Todas as determinações foram realizadas em triplicata. O conteúdo total de fenólicos foi expresso como miligrama equivalente ao ácido gálico por grama de extrato (mg EAG/g) seco da amostra, considerando-se o desvio padrão (DP). Utilizando-se como padrão o ácido gálico marca Sigma, para construir uma curva de calibração, expressando os resultados em mg de ácido gálico/100 mg de amostra. Y= 0,03295 (± 0.002583) x + 0.1529 (± 0.02962). R²=0,9645.

Determinação da atividade sequestradora de radicais livres

A atividade antirradicalar foi determinada pelo método de doação de hidrogênio para o radical DPPH (2,2-difenil-1- picril-hidrazil) a coloração púrpura, se reduz formando o DPPH-H (hidrazina) de coloração amarela, seguindo a metodologia descrita por Silva et al.^[15] com pequenas modificações. As amostras do presente estudo tiveram sua CE₅₀, que expressa a quantidade de antioxidante necessária para reduzir em 50% a concentração inicial de DPPH. Foram preparadas soluções em etanol em várias faixas de concentração; 1,0 mg/mL até 100 μg/mL, 100 μg/mL até 1000 μg/mL, 1000 μg/mL até 5000 μg/mL. Após ensaios preliminares, foi escolhida a faixa com melhor linearidade para a amostra. A amostra do extrato teve quantidades apropriadas transferidas para eppendorfs de 500 μL, em seguida foi adicionado 450,0 μL da solução de DPPH• (23,6 μg/mL em EtOH) e o volume foi completado para 500,0 μL com EtOH, afim de obter concentrações finais que variaram de 1,0 a 400 μg/mL. A mistura ficou sob agitação em aparelho ultrassônico durante 30 minutos, protegida da luz. Uma alíquota da mistura (300 μL) foi transferida para placa de 96 poços, usando como branco EtOH e a absorbância foi detectada em espectrofotômetro Elisa UV-Vis a 517 nm. Todas as determinações foram realizadas em triplicata. Como controle positivo foi empregado o hidroxitolueno butilado (BHT). A percentagem de atividade sequestradora (% AS) foi calculada pela equação:

Onde A controle é a absorbância do controle, contendo apenas a solução etanólica do radical DPPH, e A amostra é a absorbância do radical na presença do extrato ou do padrão. A eficiência antirradicalar foi estabelecida utilizando a análise de regressão linear no intervalo de confiança de 95% (p<0,05) obtido pelo programa estatístico GraphPad Prism 5.0 (DEMO). Os resultados foram expressos através da concentração da amostra necessária para inibir 50% da atividade sequestradora máxima dos radicais mais ou menos o desvio padrão (CI₅₀ ± D.P.).

Avaliação da atividade antimicrobiana

Obtenção e padronização das cepas bacterianas

Nesse estudo, foram utilizadas cepas bacterianas Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Salmonella entérica (ATCC 14028), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), mantidas em cultura-estoque sob refrigeração a -8°C no laboratório de Microbiologia da Faculdade de Medicina de Juazeiro do Norte/ Estácio-CE.

Previamente aos testes, as linhagens bacterianas foram inoculadas e reavivadas em meio Brain Heart Infusion (BHI) caldo a 3,8% e incubadas durante 24 horas a 35 ± 2ºC. Após este pré-cultivo, procedeu-se à padronização do inóculo, que consistiu na preparação de uma suspensão bacteriana em BHI a 3,8%, com turvação correspondendo a 0,5 da Escala McFarland (1x 10⁸ UFC/mL). Em seguida essa suspensão foi diluída até 1x 10⁶ UFC/mL em caldo BHI a 10%, e volumes de 100 μL foram então homogeneizados em placa de microdiluição com 96 poços, acrescido de diferentes concentrações dos extratos, resultando num inóculo final de 1x 10⁵ UFC/mL.

Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

A concentração inibitória mínima de Ervatamia coronaria e dos antibióticos usados como controle positivo dos testes (Clindamicina, gentamicina, amicamicina, cefalexina e azitromicina), sobre as cepas foi determinada pelo método Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)^[16], a partir da técnica de microdiluição em placas estéreis de 96 orifícios, providas de tampa.

Inicialmente foi pesado 2048 µg do extrato, foi diluído em eppendorf acrescentando 1000 µL de água estéril, de forma a obter uma concentração de 1024 μg/mL. Para preenchimento das placas, adicionando-se 100 μL do meio de cultura BHI a 3,8% em todos os orifícios. Em seguida acrescentou-se 100 μL extrato diluído, homogeneizando e realizando diluições seriadas de 1024 μg/mL a 0,5 μg/mL. Posteriormente foram distribuídos 5 µL das suspensões dos microrganismos em cada orifício das microplacas.

As placas foram incubadas em estufa a 35±2°C durante 24 horas completas, para ocorrer o possível crescimento ou inibição das bactérias frente ao extrato de E. coronaria e os antibióticos de controle positivo. Os testes foram realizados em triplicata. A CIM foi avaliada seguido a classificação de critérios da atividade antimicrobiana do extrato, descrita por Holezt et al.^[17], com adaptações (QUADRO 1).

Resultados e Discussão

A determinação do teor de fenóis totais, obtido através do método de Folin- ciocalteu, foram expressos equivalente ao ácido gálico (EAG) g, do extrato hidroetanólico das folhas de Ervatamia coronária (EEtOH), apresentados na (TABELA 1) é de 26,15± 1,82 (mg GAE/g extrato). O extrato de E. coronaria apresenta teor de fenóis totais baixo, assim como mostra a literatura sobre outras espécies da mesma família^[15].

Pode-se correlacionar positivamente o teor de fenóis totais com a CI₅₀ no ensaio de DPPH. Esta avaliação sugere que a Ervatamia coronaria pode apresentar algum constituinte químico que contribua de forma efetiva para a ação sequestradora de radicais livres, tendo em vista que os testes foram realizados com o extrato na forma não purificada^[18].

A atividade antioxidante do extrato das folhas verdes de Ervatamia coronaria, obtido a partir do extrato não purificado, apresentou CI₅₀ no ensaio de DPPH de 32,80± 1,10 (TABELA 2), valor mais elevado que o ácido ascórbico que apresentou CI₅₀ de 3,93± 1,14.

A TABELA 3 apresenta os valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) do extrato hidroetanólico de Ervatamia coronaria. Nas concentrações testadas o extrato não apresentou atividade de inibição microbiológica CIM > 1024 µg/mL, quando submetidas ao teste de inibição nas cepas bacterianas, Escherichia Coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Salmonella enterica (ATCC14028), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), sendo assim inviável para pesquisas de importância clínica.

Os valores de CIM para E. coli (ATCC 25922) ≥ 426,66 µg/mL para o antibiótico azitromicina e ≥ 341,33 µg/mL para cefalexina, S. enterica (ATCC 14028)≥ 128 µg/ ml do antibiótico azitromicina e ≥ 0,5 µg/ ml de cefalexina, indicam que estes antibióticos inibem o crescimento desta bactéria nestas concentrações, funcionando como controle do teste. Assim como, os valores de CIM para P. aeruginosa (ATCC 9027)≥ 512 µg/ ml do antibiótico azitromicina, que atuou como controle do teste.

Ervatamia coronaria é um dos gêneros da família Apocynaceae, não apresentando atividade antimicrobiana frente às cepas testadas, mesmo apresentando em seus metabólitos secundários constituintes químicos como, triterpenos, alcaloides e esteroides que geralmente atuam de forma favorável como atividade antimicrobiana^[19].

Outros gêneros da mesma família como: Tabernaemontana catharinensis, Tabernaemontana divaricata, Calotropis procera, evidenciou atividade antimicrobiana significativa em estudos com as cepas bacterianas, as Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus aureus apresentam atividade antimicrobiana^[20]. Ervatamia chinesis, outro gênero da família Apocynaceae exibe atividade antimicrobiana frente Bacillus subtilis^[21].

Desta forma é relevante correlacionar os resultados dos testes do extrato hidroetanólico, com a atividade antioxidante e antimicrobiana de Ervatamia coronaria, tendo em vista que os resultados podem ser diretamente interferidos, quando extrato utilizado na forma não purificada, diminuindo assim a concentração destes metabólitos secundários^[22]. Já que a literatura relata atividades terapêuticas satisfatórias em outras espécies da mesma família^[23].

Conclusão

De acordo com os parâmetros analisados no estudo, a espécie analisada apresenta um potencial antioxidante favorável. O extrato apresenta baixo teor de fenóis, além de se mostrar clinicamente irrelevante frente às cepas bacterianas usadas no teste,mesmo contendo nos seus constituintes químicos metabólitos secundários que favorecem para tal atividade. Dessa forma é possível recomendar que esse extrato possa ser um candidato a se tornar um novo fitomedicamento antioxidante, mas não um antibacteriano de origem vegetal.

Salienta-se também que este resultado é específico para esta espécie, já que outras espécies foram testadas antes e apresentaram atividade satisfatória, como consta na literatura, podendo está relacionado a baixa concentração desses metabólitos, tendo em vista que o extrato usado nos testes estava na forma bruta. Assim, faz-se necessária a realização de fracionamento do extrato hirdroetanólico, visto que, a planta Ervatamia coronaria apresenta metabólitos que favorecem para as atividades farmacológicas testadas.

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