Estudo químico e avaliação da atividade antimalárica dos galhos de Piranhea trifoliata

Resumo

Este trabalho teve como objetivos realizar o estudo químico dos galhos de Piranhea trifoliata (Picrodendraceae) e avaliar o seu potencial antimalárico. Foram realizadas duas coletas no Estado do Pará. O material foi seco, moído e extraído com diclorometano (DCM), metanol (MeOH) e água (H₂O). Os extratos DCM e MeOH foram submetidos à análise em cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), e apresentaram características principalmente de terpenos. Do estudo fitoquímico do extrato DCM da 2ª coleta, foi isolada: friedelan-3-ona e do extrato MeOH da 2ª coleta foi isolado: o triterpeno esqualeno, e mistura dos esteroides estigmasterol e β-sitosterol. Quanto à atividade antimalárica, os extratos e as fases dos extratos MeOH foram avaliados in vitro frente ao Plasmodium falciparum, e os extratos MeOH da 1ª e 2ª coletas foram considerados ativos (CI₅₀ = 13,7 µg/mL; CI₅₀ = 5,8 µg/mL, respectivamente). Este trabalho contribuiu para o conhecimento biológico e químico da espécie Piranhea trifoliata e da família Picrodendraceae, sendo este o primeiro relato de atividades biológicas para a espécie em estudo.

Palavras-chave:

Picrodendraceae.

Triterpenos.

Esteroides.

Terpenoides.

Piranhea.

Abstract

The objective of this work was to carry out the chemical study of Piranhea trifoliata (Picrodendraceae) branches and to evaluate their antimalarial potential. Two collections were performed in the State of Pará. The material was dried, ground and extracted with dichloromethane (DCM), methanol (MeOH) and water (H₂O). The DCM and MeOH extracts were subjected to comparative thin layer chromatography (TLC) analysis and showed characteristics mainly of terpenes. From the phytochemical study of the second collection DCM extract, it was isolated: friedelan-3-one and the second collection MeOH extract was isolated: the squalene triterpene, and the mixture of the stigmasterol and β-sitosterol steroids. Regarding antimalarial activity, MeOH extracts and phases were evaluated in vitro against Plasmodium falciparum, and MeOH extracts from the 1^st and 2^nd collections were considered active (IC₅₀ = 13.7 µg/mL; IC₅₀ = 5.8 µg/mL, respectively). This work contributed to the biological and chemical knowledge of the species Piranhea trifoliata and Picrodendraceae family, this being the first report of biological activities for the species under study.

Keywords:

Picrodendraceae.

Triterpenes.

Steroids.

Terpenoids.

Piranhea.

Introdução

A malária é uma das doenças infecciosas mais devastadoras e comuns em todo mundo e uma das principais ameaças em matéria de saúde pública em mais de 90 países^[1-3]. Ela é uma doença altamente recorrente em países tropicais e subtropicais^[4]. É uma das doenças negligenciadas de países subdesenvolvidos.

Em 2015, foram relatados 212 milhões de casos clínicos e 429 mil mortes, ocorrendo em grávidas e, principalmente em crianças, sendo que, de acordo com a OMS^[5] 78% dos casos fatais ocorreram em crianças menores de 5 anos de idade, dados estes observados no continente africano. Os tratamentos utilizados após o diagnóstico da doença geralmente incluem dois medicamentos associados que causam alguns efeitos colaterais e têm pouca adesão do paciente^[6]. Este tratamento é bastante complexo, longo e muitas vezes ineficaz devido à reinfecção do paciente, muito comum nas áreas de incidência da doença^[7].

A ineficácia do tratamento antimalárico disponível é a principal razão por trás da sua ameaça. Esse grande problema está na resistência do Plasmodium falciparum, aos fármacos existentes e a toxicidade de drogas em seres humanos^[8-11]. As principais drogas antimaláricas atualmente utilizadas são divididas em quatro categorias: quinolinas (quinina, cloroquina, amodiaquina, mefloquina e primaquina), antifolatos (pirimetamina, proguanil e sulfadoxina), derivados da artemisinina (artemisinina, artesunato, arteméter e arteéter) e hidroxinaftoquinonas (atovaquina)^[12].

Porém, devido às dificuldades de acesso encontradas para o tratamento da doença, parte da população utiliza plantas medicinais no tratamento da malária. E algumas plantas já demonstraram o seu potencial para fornecer substâncias eficazes para o tratamento da doença, tais como a quinina e artemisinina, as quais foram isoladas de plantas. O que gera um interesse em procurar nas plantas novas alternativas terapêuticas com eficácia igual ou superior às já existentes^[1].

O surgimento de cepas de P. falciparum resistentes a quase todos os antimaláricos levaram químicos e biólogos a estudar a sua substituição efetiva com um mecanismo de ação alternativo e novas moléculas^[13]. Dentro destas perspectivas, pesquisas em busca de novas substâncias bioativas extraídas de plantas medicinais se tornaram um importante ponto a ser considerado.

Nesta busca de novos antimaláricos extraídos de plantas, podemos destacar o gênero Piranhea, do qual há estudos fitoquímicos relatados na literatura da espécie P. mexicana pela sinonímia Celaenodendron mexicana, da qual foram realizados estudos químicos e isolados terpenos. Também foi relatada que esta espécie é utilizada por índios mexicanos como antisséptico, possui atividade antimalárica, citotóxica e antiprotozoária^[14-16]. Assim, o gênero Piranhea é uma fonte promissora de terpenos, e possui um potencial antimalárico, deste modo estudos de novas espécies de Piranhea fazem-se necessários para a quimiotaxinomia do gênero, do qual se tem poucos estudos.

A espécie Piranhea trifoliata é uma árvore bastante encontrada na América do Sul^[17,18] e popularmente conhecida como Piranheira, pois seus frutos e sementes servem de alimentos para cardumes de piranhas^[19]. É uma árvore grande de até 25 metros de altura e vive mais de 400 anos^[19,20]. É frequentemente encontrada nas regiões de várzeas e igapós, e sua casca é usada como curativo para inflamações no útero em banhos de assento e para chás no tratamento de malária^[19]. Na literatura foi encontrado apenas um estudo fitoquímico, realizado pelo nosso grupo de pesquisa, das folhas de P. trifoliata no qual foram isolados 6 triterpenos^[21], não havendo relato de estudos sobre suas atividades biológicas.

Neste contexto, este trabalho teve como objetivo realizar o estudo químico dos extratos DCM e MeOH dos galhos de P. trifoliata e avaliar o seu potencial antimalárico.

Material e Métodos

Coleta e identificação do material vegetal

Os galhos foram coletados duas vezes. As duas coletas foram realizadas em Altamira, na Volta Grande do Xingu no estado do Pará, sendo a primeira coleta em novembro de 2008 e a segunda em agosto de 2009. As exsicatas foram catalogadas e registradas no herbário do Instituto Federal de Ciência e Tecnologia do Amazonas – IFAM, sob os números 10652 para a 1ª coleta e 10654 para a 2ª coleta. A coleta teve autorização do IBAMA número: 16970-1.

Obtenção dos extratos vegetais

Os galhos foram secos em estufa a 50 °C por aproximadamente dois dias, e posteriormente triturados em moinho de facas para o preparo dos extratos. O material seco foi extraído com solventes de polaridade crescente, diclorometano (DCM), metanol (MeOH) e água (H₂O). Foram realizadas três extrações utilizando ultrassom por 20 minutos, a cada extração realizada. Após cada extração, o extrato obtido foi filtrado e seco, utilizando evaporador rotativo, sob pressão reduzida, em temperatura < 50 °C. Os extratos brutos DCM e MeOH das duas coletas foram comparados por CCDC e por serem distintos não foram reunidos. Os extratos aquosos não foram utilizados neste estudo e foram guardados em refrigeradores para futuros estudos.

Análise cromatográfica em camada delgada comparativa (CCDC)

Os extratos de P. trifoliata foram analisados por CCDC com o objetivo de averiguar a complexidade química dos extratos. Os extratos DCM e MeOH da 1ª e 2ª coleta foram submetidos a análise por CCDC e revelados com alguns reveladores químicos e físicos, para detecção das classes dos constituintes químicos presentes em cada extrato.

Após eluição as placas foram reveladas com luz UV (comprimento de onda de 254 e 365 nm) e, também, com alguns reagentes químicos, para detectar a presença de algumas classes químicas, tais como: Ce(SO₄)₂ para detecção de terpenos, anisaldeído para detecção de terpenos entre outras classes, FeCl₃ para detecção de substâncias aromáticas, AlCl₃ para confirmar a presença de flavonoides. Assim, consequentemente, foi possível estabelecer uma estratégia para a separação e purificação de suas substâncias.

Isolamento dos constituintes químicos dos galhos de P. trifoliata

O extrato DCM (5 g) da primeira coleta foi submetido a uma coluna filtrante (CCF) de sílica gel utilizando os solventes: DCM, acetato de etila (AcOEt) e MeOH. A fração 1-2 (3,5 g) foi refracionada em cromatografia em coluna aberta (CCA) de sílica gel utilizando como fase móvel misturas de solventes (HEX/DCM; DCM/AcOEt e AcOEt/MeOH). Das frações resultantes a fração 21 (45,7 mg), foi submetida   a um novo fracionamento em CCA usando sílica gel como adsorvente e eluida com misturas dos solventes (HEX/AcOEt e AcOEt/MeOH), resultando na fração 13 (6,3 mg) denominada de substância 1.

O extrato MeOH (130,0 g) foi submetido a uma partição líquido-líquido, a qual permitiu a obtenção de três fases, desta a fase DCM (2,41 g) foi fracionada em CCA usando sílica gel como fase estacionária usando como fase móvel misturas dos solventes (HEX/DCM; DCM/AcOEt e AcOEt/MeOH). De fracionamentos sucessivos da fase DCM obteve-se as frações 31-32 (2,2 mg) denominada de substância 2, a fração 3 (1,0 mg) denominada de substância 3 e na fração 42-46 (9,4 mg) denominada de substância 4 e 5.

Métodos espectroscópicos

Os espectros de RMN de ¹H e ¹³C foram obtidos em equipamento Bruker BioSpin AG, modelo Fourier 300 Ultrashield, 300 MHz para ¹H e 75 MHz para ¹³C, as frações foram analisadas por RMN de ¹H e de ¹³C mono e bidimensionais, utilizando na dissolução das amostras clorofórmio deuterado com TMS. Os deslocamentos químicos () foram expressos em partes por milhão (ppm) e as constantes de acoplamento em Hz.

Avaliação da atividade antimalárica

Os testes in vitro dos extratos DCM e MeOH foram realizados com hemácias infectadas por P. falciparum, clone W2, resistente a cloroquina, através do método LDH (lactato desidrogenase)^[22]. As amostras foram solubilizadas com DMSO resultando uma solução estoque de cada amostra na concentração de 50 mg/mL. A cloroquina foi utilizada como antimalárico padrão e considerada muito ativa com valor de CI₅₀ = 0,145 mg/mL.

A incubação, parasito-droga, foi realizada com 20 mL de cada diluição dos compostos testados colocados em microplacas de 96 poços, em triplicata, onde já se encontravam 180 mL da suspensão de hemácias infectadas (1% hematócrito, 2% de parasitemia), provenientes de um cultivo. Foram usados controles sem drogas, com hemácias infectadas (controle positivo) ou hemácias não infectadas (controle negativo).

Em seguida, as placas foram incubadas em atmosfera de 5% de CO₂ a 37 ºC por 48 h, com amostras e controles. Após esse período as microplacas foram congeladas (-20 ºC no mínimo por 24 h), para promover a lise das hemácias.

O lisado celular foi transferido para placas de 96 poços, aos quais foram adicionados 100 µL de reagente Malstat e 25 µL de reagente NBT/PES. Após 1 h de incubação, a absorbância de cada poço das placas foi registrada em espectrofotômetro (540 nm).

Os percentuais de redução do crescimento dos parasitos foram calculados a partir da absorbância.

As amostras foram avaliadas em dois experimentos independentes. As amostras foram testadas em duas concentrações, 25 e 50 µg/mL, cada uma em triplicata, para a avaliação do percentual de redução da parasitemia. Aquelas que apresentaram percentual de redução de parasitemia igual ou maior que 50%, foram selecionadas para determinação das CL₅₀, sendo realizados testes em 6 diferentes concentrações.

Os resultados foram avaliados no programa Origin 8.0 com determinação das curvas dose-resposta traçadas com ajuste sigmoidal. Foram determinadas as concentrações inibitórias do crescimento de 50% dos parasitos (CI₅₀) em relação aos controles sem drogas.

Avaliação de citotoxicidade

Após a realização da avaliação da atividade antimalárica, amostras consideradas ativas no teste antimalárico, foram submetidas ao ensaio de citotoxicidade in vitro na linhagem celular HepG2 A16, derivada de um hepatoblastoma primário humano.

Primeiramente as células derivadas da linhagem celular HepG2 foram distribuídas em microplacas de 96 poços (4x10⁵ células/100 µL por poço) e incubadas em estufa de CO₂ à 37 °C por 24 h para a adesão das células à placa.

Em seguida, foram adicionados 100 µL de meio completo contendo diferentes concentrações dos extratos testados em triplicata. As placas foram incubadas por mais 24 h. 

Ao final deste período, foram adicionados 18 µL/poço de uma solução brometo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), na concentração de 20 mg/mL. Após 1 h e 30 minutos a leitura foi realizada em espectrofotômetro a 492 nm.

A dose letal mínima que inibe em 50% o crescimento das células na presença dos extratos testes e de antimaláricos controles foi determinada em comparação com células cultivadas sem a presença de compostos, considerada 100% de crescimento.

Os resultados foram avaliados no programa Origin 8.0 com determinação das curvas dose-resposta traçadas com ajuste sigmoidal. Foram determinadas as concentrações citotóxicas que inibem em 50% o crescimento das células (CC₅₀) em relação aos controles sem drogas.

Para as amostras consideradas ativas foi calculado o índice de seletividade que é dado pela razão entre o valor obtido de CC₅₀ para células HepG2 e o valor de CI₅₀ para P. falciparum.

Resultados e Discussões

Coleta do Material Vegetal e Obtenção dos Extratos

Foram coletados galhos (FIGURA 1) de duas coletas diferentes (TABELA 1). Foram obtidos seis extratos e os extratos aquosos foram guardados em refrigerador para estudos futuros. Dos 4 extratos resultantes estudados, foi observado que os metanólicos para as duas coletas foram os que apresentaram uma maior porcentagem de rendimento (TABELA 1), destacando-se principalmente a 1ª e a 2ª coleta com rendimentos acima de 5%, já os extratos diclorometânicos obtiveram rendimentos inferiores a 1%.

Análise cromatográfica em camada delgada comparativa (CCDC)

A análise em camada delgada comparativa (CCDC) dos extratos DCM da primeira e da segunda coleta indicaram a presença de terpenos, observados quando as placas foram reveladas com sulfato cérico, pois apresentaram uma coloração vermelha intensa. Observou-se também a presença de substâncias fluorescentes sob a luz UV em 365 nm, um indicativo da presença de substâncias aromáticas. Quando revelados com DPPH mostraram a presença de possíveis antioxidantes pela coloração amarelada. Não foi identificada a presença de alcaloides quando as placas foram reveladas com o Reagente de Dragendorff, pois não se verificaram manchas de coloração alaranjada.

Os extratos MeOH dos galhos apresentaram a presença de terpenos nos extratos da primeira e segunda coleta, quando as placas cromatográficas foram reveladas com sulfato cérico, pois apresentaram uma coloração vermelha intensa. Quando as placas cromatográficas foram reveladas com DPPH mostraram a presença de possíveis antioxidantes pela coloração amarelada. Também não foi identificada a presença de alcaloides quando as placas cromatográficas foram reveladas com o Reagente de Dragendorff.

Ao comparar as duas coletas é possível observar que há muita diferença entre as coletas realizadas, o que pode ter sido influenciado pela diferença de localidades e sazonalidade das coletas. Esses extratos mostraram-se ricos quimicamente revelando uma grande quantidade de possíveis substâncias a serem isoladas.

Substâncias Isoladas dos galhos de Piranhea trifoliata

A substância 1 (S-1) obtida do extrato DCM dos galhos da 2ª coleta, apresentou-se na forma de cristais brancos, e quando revelada com Ce(SO₂)₄ verificou-se a coloração vermelha, com Rf = 0,35, quando eluída com HEX/AcOEt 95:05.

O espectro de RMN de ¹H da S-1, apresentou sinais na região de dH 0,73 a 1,26 ppm, sendo 7 simpletos em dH 0,73; 0,89; 0,96; 1,00; 1,01; 1,05; 1,18; e um dupleto em dH 0,87 (6,58 Hz), sendo estes oito sinais referentes a 8 metilas, sugerindo que se tratava de um triterpeno. Não foi observada a presença de ligações duplas na região de dH 5,0 e 6,0, indicativo de um esqueleto friedelano e sinais entre dH 1,3 e 2,5 referentes aos hidrogênios metilênicos e metínicos.

O espectro de RMN de ¹³C mostrou a presença de 30 sinais, sendo um sinal em δ_C 213,0 indicando a presença de uma carbonila. Também foi possível confirmar a ausência de sinais de ligação dupla nas regiões de δ_C 100 a 150. E em δ_C 6,8 observou-se o sinal referente a metila na posição C-23, característico do esqueleto friedelano.

As análises dos dados dos espectros de RMN de ¹H e ¹³C foram comparadas com dados da literatura^[23] (TABELA 2), sendo assim possível confirmar a S-1 como sendo o triterpeno friedelan-3-ona (FIGURA 2).

A substância friedelan-3-ona está sendo relatada pela primeira vez nos galhos de P. trifoliata, porém esta substância já foi isolada das folhas de P. trifoliata^[21].

A substância 2 (S-2), obtida da fase DCM do extrato MeOH dos galhos da 2ª coleta, apresentou-se na forma de cristais brancos e Rf = 0,4, quando eluída com Hex/AcOEt 7:3. O seu espectro de RMN de ¹H mostrou alguns sinais na região dos aromáticos em dH 7,05 (¹H, d, J = 8,5 Hz, H-5), dH 7,44 (¹H, dd, J = 8,5 e 1,8 Hz, H-6), dH 7,42 (¹H, d, J = 1,8 Hz, H-2), mostrou singleto em dH 9,82 confirmando a presença do grupo aldeído, e em dH 3,97, relativo ao grupo metoxílico. Os dados foram comparados com a literatura^[24] (TABELA 3) e foi possível confirmar S-2 como sendo a substância fenólica 3-metoxi-4-hidroxi-benzaldeído (FIGURA 3), sendo este o primeiro relato desta substância na família Picrodendraceae.

A substância 3 (S-3) obtida da fase DCM do extrato MeOH dos galhos da 2ª coleta, apresentou-se na forma de cristais brancos, e quando revelada com anisaldeído sulfúrico verificou-se a coloração lilás, com Rf = 0,77, quando eluída com Hex/DCM 9:1.

O espectro de RMN de ¹H da S-3 apresentou sinais em δ_H1,68 (s, 6H) e 1,60 (s, 18H). Os hidrogênios em δ_H 1,68 atribuídos a grupos metílicos ligados a carbonos olefínicos nas posições C-1 e C-24 em δ_H 1,60 (s, 18H) atribuídos aos hidrogênios nas posições C-25, C-26, C-27, C-28, C-29 e C-30. Mostrou também sinais em δ_H 2,06 (m, 20H) indicando a presença de hidrogênios metilenos vizinhos a ligações duplas, e um multipleto em δ_H 5,14 (m, 6H) sugerindo a presença de hidrogênios olefínicos. Não foi possível realizar análises dos espectros de carbono, devido a quantidade de massa obtida ter sido pouca. Os dados do espectro de RMN de ¹H foram comparadas com dados da literatura^[25] (TABELA 4) e foi possível confirmar S-2 como sendo o triterpeno esqualeno (FIGURA 4).

A substância esqualeno está sendo descrita pela primeira vez no gênero Piranhea. Esta substância é um triterpeno, classe química de metabólitos secundários, considerada marcadores químicos da família Picrodendraceae.

As substâncias 4 e 5 (S-4 e S-5) obtidas da fase DCM do extrato metanólico dos galhos da 2ª coleta, apresentaram-se na forma de cristais brancos e quando reveladas com Ce(SO₄)₂, verificou-se a coloração rosa com Rf = 0,33, quando eluída com DCM 100%.

O espectro de RMN de ¹H das substâncias 4 e 5 apresentou sinais nas regiões entre δH 0,69 a 2,33 ppm, referentes a hidrogênios de metílicos, metilênicos e metínicos, característicos de triterpenos e esteroides, com a presença do sinal em δ_H 0,69, um simpleto largo com integral para três hidrogênios, que é característico dos esteroides estigmasterol e β-sitosterol, foi possível inferir que as substâncias S-4 e S-5 eram esteroides. Apresentou também um multipleto em δ_H 3,52 atribuído a um hidrogênio ligado a carbono carbinólico, H-3 de ambos os esteroides. Em δ_H em 5,35 (2H, dl, J= 5,12 Hz), atribuído ao hidrogênio olefínico na posição H-6 de ambos os esteroides, e ainda dois duplos dupletos em δ_H 5,15 (¹H,dd, J=15,18 e 8,38 Hz) e em δ_H 5,01 (¹H, dd, J= 15,18 e 8,57 Hz), referentes aos hidrogênios H-22 e H-23 do esteroide estigmasterol. A comparação dos dados espectroscópicos obtidos com os descritos na literatura^[21]  (TABELA 5) permitiu confirmar que tratava-se da mistura constituída pelos esteroides estigmasterol (FIGURA 5) e β-sitosterol (FIGURA 6), respectivamente substâncias 4 e 5 esteroides comumente encontrados em plantas. As percentagens aproximadas dos dois constituintes na mistura foram calculadas com base na integração dos sinais correspondentes a H-6 (intensidade relativa: 1,70, relativo aos dois esteroides 4 e 5) e H-22 e H-23 (intensidade relativa: 2,09) relativo a dois prótons do molécula do estigmasterol, a metade de 2,09 (2,09/2=1,045) representou um próton da molécula do estigmasterol, subtraindo este valor de 1,70 obteve-se a intensidade de 0,655 correspondente a um hidrogênio da molécula de β-sitosterol as intensidades relativas 1,045 e 0,655 permitiram deduzir que a mistura contém 61,48% de estigmasterol e 38,52% de β-sitosterol.

Avaliação da atividade antimalárica

As amostras foram testadas em duas concentrações, 25 e 50 µg/mL. Aquelas que apresentaram percentual de redução de parasitemia igual ou maior que 50% nas duas concentrações testadas foram selecionadas para determinação das CI₅₀.

Os extratos diclorometânicos da 1ª e 2ª coleta apresentaram um percentual de redução de parasitemia inferior a 50%, não sendo um percentual significativo e não tiveram a CI₅₀ determinada, pois não obtiveram um resultado satisfatório. Já os extratos metanólicos da 1ª e 2ª coleta mostram resultados satisfatórios nos experimentos realizados. Os extratos das duas coletas apresentaram 100% de redução de parasitemia nas duas concentrações (100% em 25 µg/mL e 100% em 50 µg/mL) (TABELA 6). Os extratos foram então submetidos para a determinação da CL₅₀.

Os extratos metanólicos da 1ª e 2ª coletas foram considerados ativos (CI₅₀ = 13,7 µg/mL para a 1ª coleta e de CI₅₀ = 5,8 µg/mL para a 2ª coleta) (TABELA 7).

Os estudos realizados com as fases dos extratos metanólicos da 1ª e 2ª coleta mostraram-se satisfatórios, com destaque para as fases DCM da 1ª e 2ª coleta com redução de parasitemia superior a 90% para as duas concentrações testadas para 1ª coleta (92% - 25 µg/mL e 93% - 50 µg/mL) (TABELA 8) e redução superior a 70% na concentração de 50 µg/mL para a 2ª coleta. Estas fases foram testadas para determinação da CL₅₀. As demais fases testadas apresentaram um percentual de redução de parasitemia inferior a 50%, não sendo um percentual significativo e não tiveram a CI₅₀ determinada, assim como os extratos.

Das fases testadas destacaram-se principalmente as fases DCM da 1ª e 2ª coleta, onde foram obtidos valores de CI₅₀ = 7,05 µg/mL para 1ª coleta sendo considerada ativa e CI₅₀ = entre 25 e 50 µg/mL para a segunda coleta sendo considerada pouco ativa. Já a fase AcOEt da 1ª coleta foi considerada pouco ativa (CI₅₀ = entre 25 e 50 µg/mL). E as demais fases foram consideradas inativas (TABELA 9).

Avaliação de citotoxicidade

Após análise da CL₅₀ obtida para a fase DCM da 1ª coleta, a mesma foi submetida ao teste de citotoxicidade e a concentração observada foi superior a 1000 µg/mL (TABELA 10).

Após o teste de citotoxicidade foi realizado o cálculo do índice de seletividade dado pela razão entre o valor obtido de CL₅₀ para células HepG2 e o valor de CI₅₀ para P. falciparum.

A fase DCM da 1ª coleta apresentou índice maior que 10 (TABELA 11) e não foi considerada citotóxica, e assim foi possível inferir que esta fase é mais ativa nas células do parasita do que em células normais. Sendo este fator muito importante para estudos posteriores com P. trifoliata, pois quanto menor for a citoxicidade da fase DCM para linhagem de células normais maior será a especificidade de atuação sobre o parasita a ser combatido. Este elevado índice de seletividade para o P. falciparum incentiva a realização de estudos posteriores para o isolamento das substâncias para verificar se há a presença de uma única substância ou várias que sejam responsáveis pela atividade antimalárica.

Pela literatura consultada, pode-se relacionar parte da atividade antimalárica dos extratos desta espécie com a presença do triterpeno fridelina isolado dos galhos, pois há relato da atividade antimalárica desta substância frente ao Plasmodium falciparum na concentração de 7,70 µM^[26]. No entanto, uma vez que o extrato DCM, que é rico em triterpenos desta classe, não apresentou atividade antimalárica, deve haver outras substâncias que sejam ativas sobre a cepa utilizada de P. falciparum. Indicando assim que Piranhea trifoliata é uma fonte de substâncias com atividade antimalárica ainda por conhecer.

Conclusão

O estudo fitoquímico dos galhos de P. trifoliata, permitiu o isolamento das substâncias: friedelna-3-ona, 3-metoxi-4-hidroxi-benzaldeído, esqualeno e a mistura dos esteroides estigmasterol e β-sitosterol. O esqualeno e a substância fenólica estão sendo descritos pela primeira vez na família Picrodendraceae.

As análises por cromatografia em camada delgada comparativa revelaram que os extratos DCM e MeOH de ambas as coletas são ricos em terpenoides.

Os extratos metanólicos dos galhos de P. trifoliata apresentaram um potencial antimalárico frente ao P. falciparum, sendo ainda necessários estudos químicos para o isolamento das substâncias ativas.

Os resultados obtidos neste trabalho contribuíram para o conhecimento biológico e químico tanto da espécie Piranhea trifoliata como de sua família Picrodendraceae. Sendo duas das substâncias isoladas relatadas pela primeira vez na família assim como as atividades biológicas para a espécie em estudo.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq (projetos PPBio/CNPq, REPENSA/CNPq, CT-Agro/CNPq, CTAmazônia/CNPq e bolsas de produtividade de ABO e CVN) e CAPES (projeto Pro-Amazônia/CAPES) pelo apoio financeiro e pelas bolsas concedidas.

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