A hortaliça Eruca vesicaria (L.) Cav., popularmente conhecida como rúcula, apresenta vários benefícios à saúde tais como, atividades anti-inflamatórias e antioxidantes em organismos vivos, por apresentar em sua composição proteínas, vitaminas A e C, sais minerais e flavonoides. Os flavonoides têm recebido muita atenção nos últimos anos devido aos vários efeitos benéficos, como auxiliador no controle de processos anti-inflamatórios. O trabalho teve como objetivo quantificar flavonoides totais da rúcula produzida de forma hidropônica na região oeste do Paraná, utilizando agitação mecânica por Shaker a 170 rpm, com diferentes tempos (12, 24, 36 e 48 h) e temperaturas (25°C e 55°C), além de, também, considerar o tempo de cultivo da planta (7, 14 e 21 dias). O material vegetal fresco foi cortado e utilizou-se 5 g das folhas da hortaliça, com a umidade de 92%, a 100 mL de solvente (metanol e água). Após a obtenção dos extratos, realizou-se a leitura dos flavonoides totais no espectrofotômetro UV-Vis em comprimento de onda 440 nm, em comparação com a curva padrão de quercetina. Para os testes realizados, o resultado mais satisfatório foi obtido com metanol (MeOH) 80%, no tempo de extração de 12 h a 55°C, utilizando a planta cultivada por 7 dias.

Eruca vesicaria (L.) Cav., também denominada de Eruca sativa Miller, é conhecida popularmente como Rúcula, e considerada uma planta natural com altos teores benéficos[1], pertencente à família Brassicaceae, possuindo um sabor picante e odor agradável. Suas folhas são usadas geralmente na forma de saladas. Entre as suas espécies, apenas três são de consumo humano, sendo a Eruca sativa Miller a mais consumida no Brasil[2].

Segundo Stringheta et al.[3], o consumo de hortaliças como rúcula, couve, agrião, espinafre, acelga e brócolis auxilia consideravelmente na proteção do organismo contra doenças degenerativas devido à existência de antioxidantes. Dessa forma, obtendo o extrato a partir da rúcula pode proporcionar a maior concentração de flavonoides para possíveis aplicações terapêuticas, podendo-se conhecer melhor a qualidade do vegetal e suas atividades[4,5].

Os principios ativos de compostos oriundos de plantas têm sido estudados no tratamento de várias doenças, incluindo os processos inflamatórios de várias razões, fornecendo assim um alívio dos sintomas. Entre os abundantes princípios ativos presentes na natureza, os flavonoides integram uma das mais importantes classes dessas substâncias[6]. Os metabólitos secundários desempenham um papel importante na fitoterapia por possuírem vários efeitos biológicos e fornecendo tratamento para as variadas doenças, além de terem como função principal a de proteger as plantas dos patógenos[6,7].

Os princípios ativos das plantas são substâncias responsáveis pelo efeito terapêutico. Entretanto, a sua atividade está relacionada com a quantidade presente[8]. Assim, a determinação desses princípios ativos é muito importante, pelo fato de que a quantidade de substâncias ativas presentes em uma determinada planta diferencia-se segundo às características climáticas, a que se expõe no seu local de cultivo (habitat, regime de chuvas, insolação, tipo de solo, sazonalidade, etc.), à idade da espécie, à época da colheita e às condições de estocagem. Por isso, a avaliação e determinação desses princípios são tarefas imprescindíveis para a aquisição de produtos de boa qualidade[7,9].

Tem sido largamente utilizado pela população, como recurso terapêutico, o emprego de ténicas com uso de plantas medicinais, o que as tornam uma das principais fontes naturais de compostos biologicamente ativos[6]. No início do ano de 2000, a Organização Mundial da Saúde (OMS) apresentou dados de que cerca de 80% da população mundial manipulavam e utilizavam plantas medicinais, hortaliças, para combater algum problema de saúde, como pressão alta, gripe, tosse, entre outras doenças[9,10].

Os produtos naturais podem ser utilizados como compostos para o equilíbrio de pragas e doenças[11,12], além de muitos serem utilizados na alimentação humana com a finalidade de destacar o sabor e preservar os alimentos[13].

As plantas exibem diversas vias metabólicas que originam diferentes compostos, dentre os quais podem ser citadas: alcaloides, flavonoides, quinonas, taninos e terpenos [14,15].

Os flavonoides são considerados metabólitos secundários sintetizados pelas plantas, pertencentes ao grupo dos compostos fenólicos. Podem ser encontrados em frutas, verduras, hortaliças, sementes e flores, tornando-se importantes componentes da dieta humana[16]. Flavonoides são compostos fenólicos que se diferenciam entre si pela sua estrutura química, apresentando 15 átomos de carbono na forma C6 – C3 – C6, apoiada no núcleo de dois anéis benzênicos (A e B), sendo esses ligados a um anel pirano (C-1,2) (FIGURA 1).

Essa classe de compostos pode ser encontrada em alimentos de forma de O-glicosídeos, com a molécula de açúcar ligada na posição 3 e, em alguns casos, na posição 7 (FIGURA 1)[18,19].

Mais de 8000 flavonoides diferentes já foram descritos e podem ser classificados de acordo com seus substituintes nos anéis (FIGURA 1)[20]. Duas das principais classes de flavonoides são: flavonois (miricetina, quercetina e kaempferol) e flavonas (apigenina e luteolina)[21,22], destacando-se esses os mais distribuídos nos alimentos e por isso os mais estudados sobre compostos anticarcinogênico.

Segundo WinkelI-Shirley[23], as antocianidinas e os flavonoides atuam nas plantas despertando interesses de polinizadores e disseminadores de sementes. Além disso, eles conferem pigmentação em frutas, flores, sementes e folhas. Os flavonoides têm notáveis funções de sinalização entre plantas e micróbios, de fertilidade em algumas espécies, de defesa como agentes antimicrobianos e de proteção à radiação ultravioleta.

As antocianidinas são pigmentos fenólicos solúveis em água, que pertencem à classe dos flavonoides responsáveis pelas variações de cor, gradativamente entre laranja, vermelho e azul, visíveis nas frutas, hortaliças, flores, folhas e raízes[24,25,26]. Na alimentação humana, podem substituir os pigmentos artificiais utilizados na produção de comida industrializada.

Já os flavonoides, denominados isoflavonas, pertencem à classe dos fitoestrógenos e estão amplamente distribuídos no reino vegetal[27].

Huber et al. [17] (TABELA 1) avaliaram as diversas fontes de flavonoides entre hortaliças consumidas no Brasil, de primeira analisaram 20 tipos de hortaliças e verificaram que as principais fontes de flavonoides são: cebola, couve e rúcula com relevantes teores de quercetina; rúcula e couve, com elevados teores de kaempferol e; salsa, com grande quantidade de apigenina. Arabbi et al.[28] também analisaram algumas hortaliças, entre elas: a alface, almeirão, cebola, laranja, pimentão, rúcula, maçã e tomate, e encontraram os maiores teores de quercetina em cebola roxa, e cebola branca. Já o kaempferol foi encontrado somente em almeirão e rúcula.

A quercetina (3’,4’,3,5,7-pentahidroxiflavonol) (FIGURA 1) é classificada como um flavonol, e considerada como um dos flavonoides mais abundantes na natureza[29].

A organização molecular da quercetina nos vegetais depende de diversos fatores de acordo com o vegetal, e da variação das espécies. A quercetina ocorre principalmente na forma glicona, mas também pode ser encontrada como glicosídeo, tendo um ou mais grupos de açúcares na posição C3. Diferentes glicosídeos de quercetina já foram descritos, sendo a rutina (quercetina-3-O-rutinosídeo) um dos mais comuns encontrados na natureza[29]. Ela é encontrada em alguns frutos e legumes, principalmente nas folhas, nas quais está associada a diversos efeitos farmacológicos[30].

A quercetina tem corroborado a um efeito anti-inflamatório por inibição de COX- 2 e de óxido nítrico sintase. A luteolina e a quercetina também podem reduzir a ativação do sistema complemento, o que diminui a adesão de células inflamatórias no endotélio, reduzindo a resposta inflamatória[31].

A rúcula (FIGURA 2) é considerada uma hortaliça anual que pertence à família Brassicaceae, considerada de porte baixo, possui normalmente altura de 15 a 20 cm, folhas verdes e recortadas, tendo como centro de origem e de domesticação do gênero Eruca, o mediterrâneo e oeste da Ásia[32].

Segundo Trani et al.[33], para ter um bom desenvolvimento da planta e para a obtenção de folhas grandes e tenras, são necessárias temperaturas entre 15 a 18°C, sendo março a julho (outono/inverno) a melhor época de plantio. Os autores ainda relatam que, quando ocorrem temperaturas altas, a produção se prejudica, as folhas acabam ficando menores e lignificadas, tornando-se inadequadas para a comercialização. Porém, Filgueira[2] apresenta que a rúcula tem sido cultivada durante o ano todo em diferentes climas e diversas regiões brasileiras, mesmo que sua produção seja mais eficiente sob temperaturas amenas.

A hortaliça utilizada no trabalho foi a rúcula, Eruca sativa, cultivada em sistema hidropônico, com controle de umidade, temperatura e vitaminas para o seu desenvolvimento. Foi doada por um produtor da cidade de Nova Santa Rosa - PR. Esse vegetal foi escolhido para escudo, visto seu grande consumo pela população e os possíveis efeitos positivos que pode trazer à saúde humana.

Após a obtenção das hortaliças, as mesmas foram encaminhadas ao Laboratório Multiusuário de Análises Químicas (LAMAQ), da Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR / Campus Toledo, no qual foram cortadas manualmente, pesadas e encaminhadas para os métodos de extração ou acondicionadas em geladeira.

A umidade da rúcula foi medida utilizando-se uma balança de determinação de umidade com infravermelho (Bel I-thermo 163l).

Com base no artigo do Machado et al.[34], escolheu-se solvente MeOH por apresentar maior eficiência na extração de componente fenólicos totais. O trabalho do Vieira et al.[35] também mostrou resultados semelhantes, quando testada a relação entre aos solventes metanol e água, em relação à extração dos compostos fenólicos do pó de erva-mate.

Para as extrações foram utilizados 5 g da rúcula in natura cortada, de diferentes tempos de cultivo (7, 14, 21 e 24 dias de cultivo e/ou armazenamento) foram colocadas em 100 mL de MeOH 80%. As misturas foram agitadas por 12, 24, 36 e 48 h, em incubadora Shaker (Lucca 222), mantendo a agitação de 170 rpm e a temperatura controlada, variando-se a temperatura de extração (25°C e 55°C).

Para a concentração de todos os extratos obtidos, inicialmente, filtraram-se as amostras a vácuo, utilizando papel de filtro qualitativo, e, em seguida, armazenados em frasco âmbar de capacidade de 150 mL. Após a filtragem os extratos, foram encaminhados ao evaporador rotativo para a retirada dos solventes, com aquecimento inferior a 40°C e com rotação de 7 rpm. Em seguida foram devolvidos aos frascos e acondicionados em geladeira até os próximos ensaios.

Para identificação e quantificação de flavonoides totais foi utilizada a metodologia descrita no trabalho de Granato et al. [36] adaptada, no qual foram inseridos 1,2 mL de extratos em um tubo de ensaio, acrescentado com 1,2 mL de cloreto de alumínio hexaidratado 2% e 1,8 mL de acetato de sódio (50 g L-1). Após 15 min, foi realizada a leitura do máximo de absorção da solução em 440 nm de comprimento de onda em espectrofotômetro UV-Vis (Kasuaki, modelo IL-0082 100). Para o branco foram utilizados todos os solventes, exceto o extrato, no mesmo procedimento.

Para a preparação da solução padrão foi diluído 0,0021 g de padrão de quercetina em 5 mL de etanol absoluto em um balão volumétrico com capacidade de 25 mL, volume completado com água destilada/deionizada. A partir dessa solução, foram realizadas diluições seriadas para então obter 8 concentrações diferentes (0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 70 mg L-1). A partir da curva analítica fez-se a equação de regressão, que empregou para estimar o teor de flavonois totais nas amostras.

Para definir os dados, em que melhor condição se obtém maior quantidade de flavonoides nos extratos, realizou-se um planejamento experimental 23, considerando três fatores de impacto (temperatura, tempo de agitação e tempo de cultivo da planta) e dois níveis para cada fator (TABELA 2). Para os cálculos utilizou o software STATISTICA, versão 10, da Statsoft.

A rúcula da espécie E. sativa utilizada nesse trabalho foi produzida de forma hidropônica, o que tem a vantagem de se poder controlar os nutrientes e as condições de cultivo para a planta na região oeste do Paraná.

A umidade do vegetal, em todas as vezes que foi recebido, era determinada pela balança de infravermelho e apresentava valor em torno de 92%.

Para a quantificação de flavonoide nos extratos da rúcula foi utilizada a metodologia de determinação da absorção da banda em 440 nm utilizando o espectrofotômetro UV-Vis. A curva padrão de determinação de flavonoides foi determinada utilizando os valores de absorbância obtidos na análise espectrofotométrica das soluções com o padrão quercetina (FIGURA 3).

A partir de extratos obtidos da rúcula in natura, utilizando agitação mecânica no Shaker com MeOH 80%, variando-se o tempo de cultivo da rúcula e o tempo e a temperatura de extração (TABELA 3), obteve-se a quantidade de flavonoides fazendo-se a análise no UV-Vis e utilizando a equação da reta da curva padrão de quercetina.

A partir dos valores das absorbâncias pode-se calcular o teor de flavonoides de cada extrato obtido, utilizando-se o cálculo da curva padrão y = 89,631x - 0,6842, trocando o x pela média simples de cada amostra.

Se for comparado o valor absoluto do teor de flavonoides obtido em cada extrato nas condições experimentais, a maior quantidade foi obtida na condição de extração de 14 dias de cultivo hidropônico, com 24 h de agitação mecânica, em uma temperatura de 55°C. Entretanto, se for considerar a variância entre os valores, pode-se dizer que a melhor condição foi por 24 h de agitação a 25°C para a planta cultivada por 14 dias.

Ao realizar uma análise estatística utilizando a ANOVA (análise de variância) para todas as condições utilizadas e os resultados obtidos (TABELA 3), com 95% de limite de confiança, pode-se observar que há diferença estatística entre as médias apresentadas da quantidade determinada de flavonoides obtida para cada extrato (FIGURA 4).

De acordo com os resultados obtidos, pode-se observar que as variáveis tempo de agitação e tempo de cultivo apresentaram impacto no teor de flavonoides, além das interações: temperatura x tempo de cultivo e temperatura x tempo de agitação também.

A partir disso, pode-se imaginar que as variáveis, que indicaram diferença estatística, serão os fatores de impacto para a obtenção de flavonoides, sendo necessário fazer uma análise para verificar suas condições ótimas de extração. Para isso, foi realizada a análise dos gráficos de superfície de resposta (FIGURA 5).

Observando a FIGURA 5, podem-se ver dois gráficos de superfície de resposta que, ao se comparar as variáveis significativas, tem-se um plano gradiente que, através da cor, apresenta qual o ponto de maior obtenção da variável resposta, no caso, a quantidade de flavonoides. E nesses dois gráficos pode-se ver que: quando menor for o tempo de agitação e menor for o tempo de cultivo, maior será o teor de flavonoides extraído da rúcula. Isso indica que a melhor condição para obter maior quantidade de flavonoide no extrato da rúcula seria com 7 dias de cultivo da planta hidropônica e 12 h de extração em Shaker com agitação mecânica, utilizando um solvente de metanol 80%.

Entretanto, ao inserir a variável da temperatura de extração, pode-se verificar que a mesma interage com as outras variáveis, interferindo no teor de flavonoide determinado no extrato de rúcula. Foi realizada uma análise em resposta cúbica para verificar qual é a condição de extração quando se considera as 3 variáveis (temperatura de extração, tempo de extração e tempo de cultivo da planta), com um grau de confiança de 95% (FIGURA 6).

Ao observar os resultados da representação cúbica da análise estatística, pode-se verificar que, ao combinar as 3 variáveis, as melhores condições de obtenção do maior teor de flavonoide a partir do extrato de rúcula seriam: 7 dias de cultivo da planta; uma temperatura de extração de 55°C; extração por 12 h de agitação mecânica, utilizando solvente de 80% metanol.

Poucos trabalhados realizam essa análise de quantificação de flovonoides a partir da rúcula. A pesquisa mais próxima foi realizada por Arabbi et al.[28], que quantificaram os flavonoides presentes na rúcula, utilizando uma mistura de metanol 70 %, na proporção de 20 g de vegetal seco para 100 mL de solução extratora, e encontraram um teor de 118,1 a 40,7 mg / 100 g, em diferentes épocas de colheita. Isso indica que as condições, aqui escolhidas, podem ter uma maior aplicação, pois fornecem maior teor de flavonoide a partir da rúcula.

Nesse estudo, foram realizados vários testes de obtenção de extrato, no qual o resultado foi satisfatório, podendo chegar a um único método e eficaz. O método, que se mostrou mais favorável na obtenção do extrato com maior quantidade de flavonoide como solvente o metanol 80%, foi utilizando as condições de 55°C, com o cultivo da planta de 7 dias in natura, no tempo de agitação de 12 horas.