A Amazônia possui uma grande diversidade de frutas comestíveis, que dá origem adiversos produtos alimentícios. Essa exploração comercial gera uma quantidadesignificativa de resíduos, que possuem um potencial com atividade biológica,devido conter compostos fenólicos em suas matrizes. Assim, este estudo teve comoobjetivo empregar a metodologia de superfície de resposta para otimizar asconcentrações de etanol (X1 = 25 a 75%) e a proporção solvente:soluto (X2: 30 a90%) na recuperação de compostos fenólicos (CFT) a partir de resíduosagroindustrias de cupuaçu. O tempo do processo foi fixo em 1 h de extração a37°C usando o banho por ultrassom assistido. Os resultados sugeriram que ascondições ótimas foram concentração de etanol 50% e proporção de soluto:solvente foi de 1:100. Nas condições ótimas, o CFT experimental foi de 18,08 ±2,37 µg GAE/ mg de casca de cupuaçu seca (CCS), que foi muito próximo ao valorpredito. O modelo polinomial de segunda ordem ajustou satisfatoriamente aosdados experimentais com R2 ajustado de 89,70, implicando em uma boaconcordância entre os valores preditos e experimentais, o que indicaaceitabilidade na otimização das condições de extração de CFT da casca decupuaçu.

A Amazônia é mundialmente conhecida pela biodiversidade de sua flora. Foram descritascerca de 250 espécies de frutos comestíveis na região, entre eles oTheobroma grandiflorum (Wild. ex.spreng) K.Schum(cupuaçu)[1], o qualpertence à família Malvaceae e tem ganhado destaque no cenário nacional einternacional, devido possuírem alto teor em gordura, valor nutricional e baixocusto, movimentando a economia da região com a produção de polpas, sucos, sorvetes edoces[2,3]. Outra vertente da exploração desse fruto, que estáem ascensão, é a fabricação de cosméticos e fitofármacos, que tem voltado os olharesatentos de pesquisadores para geração de novos produtos e tecnologias a partir dessamatéria-prima[4].

A exploração comercial desses frutos gera expressivas quantidades de resíduos. Apenasa polpa e as amêndoas tem uso industrial o que provoca aumento da produção de lixoorgânico oriundo do processamento desses frutos, causando impactos ambientais emdecorrência do descarte incorreto desses materiais[5-7]. A condutamais geral adotada por algumas empresas é empregá-los como adubo orgânico, porém,estudos promissores mostram que esse resíduo possui significativos teoresnutricionais, destacando-se o potássio, ferro, selênio e antioxidantes, este últimopossuindo a capacidade de retardar o processo de degeneração celular[8-10].

São escassos os estudos com foco nos resíduos gerados a partir da exploraçãocomercial de recursos naturais, dentro desse contexto, os resíduos de T.grandiflorum, poderiam ser utilizados tanto na indústria alimentícia,na composição de rações e alimentos funcionais, quanto na indústria farmacêutica,por possuírem compostos bioativos como os fenólicos, que são associados aotratamento clínico de certas patologias[11-13], possibilitandoum emprego econômico-sócio-ambiental mais eficiente para esse subproduto.

Levando em consideração o potencial biológico e consequentemente a presença decompostos fenólicos nesses resíduos, há uma necessidade de explorar a extraçãodestes para uma possível aplicação. Para isso, torna-se necessário estudar o efeito,seja positivo ou negativo, de cada parâmetro que se deseja avaliar, o qual éespecífico para cada material, devido às diferenças nas propriedades físico-químicase morfológicas dos vegetais. Sendo assim, um protocolo universal de extração não éaceitável e um processo de extração deve ser desenvolvido e otimizado para cadafonte de compostos fenólicos[14].Com base nesses conhecimentos, o objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dosparâmetros de extração na obtenção de extrato rico em compostos fenólicos a partirda casca de cupuaçu.

Os resíduos agroindustriais de cupuaçu (RAC), provindos da extração de polpas defruta, foram doados pela Cooperativa dos Produtores Rurais de Santarém(COOPRUSAN), localizada no município de Santarém, Pará - Brasil. Os resíduosforam secos em estufa com circulação de ar a 40°C por 48 horas e transformadosem farinha, através da trituração do resíduo seco em moinho de faca ehomogeneizados em peneira com abertura de 28 mesh (0,6 mm). A farinha obtida foiacondicionada e identificada em embalagens de polietileno e armazenada emfreezer a -40ºC até o momento das extrações.

A extração dos compostos fenólicos presentes no RAC foi realizada por meio dométodo de extração assistida por ultrassom, no qual foram utilizadas soluçõeshidroetanólicas. A extração foi realizada em erlenmeyer, misturando a farinha deresíduo seco de cupuaçu (FRC) a diferentes concentrações de etanol (30 a 90%v/v, etanol: água) e diferentes razões soluto: solvente (1:25 a 1:75 m/v)conforme o planejamento experimental (TABELA 1) em um banho ultrassônico (Solidsteel, modeloSSBu - 10 L; potência fixa de 160 Watts e frequência fixa de 40 KHz) a 35°C por60 minutos. Após a extração, as amostras foram filtradas em papel de filtroqualitativo Whatman n° 1 com auxílio de bomba a vácuo, e armazenadas em freezera - 40ºC até o momento da análise.

A extração dos compostos fenólicos totais (CFT) foi otimizada estudando o efeitoda aplicação de diferentes concentrações de etanol e água (% v/v, variávelindependente X1) e da razão soluto: solvente (m/v, variável independente X2) pormeio de um planejamento composto central rotacional (DCCR) 22,contendo 4 pontos fatoriais, 4 pontos axiais e 3 repetições no ponto central,totalizando 11 ensaios, como apresentados na TABELA 1. As faixas de variação entre o limiteinferior e o superior de cada variável independente foram estabelecidas deacordo com testes realizados antes dos ensaios.

Os experimentos foram conduzidos de forma aleatória e os dados foram analisadospor meio de múltiplas regressões usando o método dos quadrados mínimos. A funçãoresposta (CFT) foi dividida em componentes linear, quadrático e a interação, eos dados foram ajustados a um modelo polinomial de segunda ordem, através daequação: YY = ββ0 + ∑2ii=1ββiixxii+ ∑2ii=1ββiiiixxii2 + ∑2ii≠jj=1ββiijjxxiixxjj,onde Y é a resposta predita (CFT); β0 é o intercepto; βi , βii e βijsão os coeficientes do modelo (linear, quadrático e interação); e xi e xj são osníveis codificados das variáveis independentes. A partir do modelo ajustado,foram gerados gráficos de superfície resposta tridimensionais e gráficos decontorno para visualizar a relação entre a resposta e os níveis de cada fator ededuzir as condições ótimas.

Para a quantificação dos fenólicos totais foi utilizado o método deFolin-Ciocalteau[15].O ensaio foi realizado adicionando 0,5 ml da amostra e 2,5 ml do reagentefolin-ciocalteau 5% em tubo de ensaio. Após 5 minutos foram adicionados 2,0 mlde carbonato de sódio 4% e as amostras foram homogeneizadas em agitador de tuboe mantidas em ausência de luz durante 2 horas. Após este período foramrealizadas as leituras a 740 nm em espectrofotômetro LGI SCIENTIFIC. Foirealizado um branco, utilizando água destilada no lugar da amostra e os ensaiosforam realizados em triplicata. Os resultados foram calculados a partir de umacurva padrão de ácido gálico e expresso em microgramas equivalentes de ácidogálico (EAG) por miligrama de amostra (µg EAG/mg de amostra).

A determinação dos flavonoides totais foi realizada de acordo comZhishen[16] commodificações. O ensaio constituiu da adição de 0,6 mL de amostra e 2,4 mL desolução cloreto de alumínio 0,1% em tubo de ensaio e mantido por 30 min atemperatura ambiente e na ausência de luz. Após este período, a leitura foirealizada em espectrofotômetro a 420 nm. O resultado foi calculado a partir deuma curva padrão de rutina e expresso em micrograma de equivalente de rutina(ER) por miligrama de amostra.

Os taninos condensados foram determinados de acordo com Salgado et al.[17]. Para a reação foramadicionados em um tubo de ensaio 0,25 mL de amostra, 1,5 mL de vanilina 4% emmetanol, e 0,75 mL de ácido clorídrico concentrado. A mistura reacionalpermaneceu em repouso por 15 minutos a temperatura ambiente e na ausência deluz. Após este período, a leitura foi realizada em espectrofotômetro a 500 nm. Oresultado foi calculado a partir de uma curva padrão de catequina e expresso emmicrograma de equivalente de catequina por miligrama de amostra.

A análise pelo método de sequestro do radical DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhidrazil) foi realizada de acordo com Brand-Williams etal.[18], com algumasmodificações. A mistura reacional foi composta pela adição de 2,4 ml de soluçãoetanólica de DPPH (29 μg/ml) e 0,6 ml de extrato. A mistura reacional foihomogeneizada e as leituras realizadas em espectrofotômetro a 516 nm até aabsorbância se manter constante. Os resultados foram calculados a partir de umacurva analítica de Trolox (±) -6-Hidroxi-2,5,7,8tetrametilcromano-2-ácidocarboxílico) e expresso em μmol ET.mg-1 de amostra seca.

A capacidade antioxidante pelo método de captura do radical ABTS (2,2 ́-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)) foi determinada conforme metodologiadescrita por Rufino et al.[19]. A solução estoque do radical ABTS foi composta por 7 mM deABTS com 140 mM de persulfato de potássio diluído em água e a mistura foimantida na ausência de luz e em temperatura ambiente por 16 h. A solução estoquefoi diluída em álcool etílico até se obter uma absorbância de 0,80 ± 0,05 a 734nm. Para o ensaio, a reação foi composta por 15 μL de amostra e 1500 μL dasolução de ABTS e a leitura realizada em espectrofotômetro a 734 nm após 6 minde reação. Os resultados foram calculados a partir de uma curva analítica deTrolox ((±) -6-Hidroxi-2,5,7,8tetrametilcromano-2-ácido carboxílico) e expressoem μmol ET.mg-1 de amostra seca.

A extração dos compostos fenólicos em matriz vegetal por ultrassom assistida ocorrepor ruptura na parede celular e liberação destes compostos. Assim, para avaliar amelhor condição da extração dos compostos fenólicos da farinha do resíduo decupuaçu, foi aplicada a técnica estatística baseada no emprego de planejamentosfatoriais denominada de planejamento experimental do tipo de planejamento rotacionalcentral (DCCR), a fim de avaliar o efeito das variáveis estudadas. Os resultadosdemonstraram que a extração foi influenciada tanto pela concentração do solventecomo pela proporção soluto: solvente no processo por ultrassom assistida, utilizandoa temperatura de 37°C por 1 hora. Os valores experimentais obtidos estão naTABELA 1.

Os resultados mostraram que o teor dos CFT variou de 6,26 a 19,0 µg GAE/mg de farinhade casca de cupuaçu, sendo o valor mínimo obtido no ensaio 7 (50% de etanol v/v; 1de soluto para 18 de solvente m/v) e o maior valor obtido no experimento 8 (etanol50% v/v; 1 de soluto para 102 de solvente m/v). Os dados experimentais foramajustados a uma modelo polinomial de segunda ordem e os coeficientes de regressãoforam calculados (TABELA 2).

A tabela dos efeitos, juntamente com a ANOVA (TABELA 3), indica que o efeito quadrático de segunda ordemfoi significativo (p ≤ 0,05) apenas para a concentração de etanol (X1) e o efeitolinear de primeira ordem foi significativo (p ≤ 0,05) para a proporção soluto:solvente (X2), enquanto o efeito de interação das variáveis (X1*X2) não foisignificativo.

A equação da regressão em nível codificado retirando os efeitos insignificantes foigerada (modelo reparametrizado), obtendo a seguinte equação:

O resultado do ajuste do modelo polinomial de segunda ordem reduzido é apresentado naTABELA 3. A ANOVAmostrou que o modelo foi altamente significativo (p < 0,0000), obtendo um bomajuste e aceitável para prever com precisão as variações, devido a não significânciada falta de ajuste. Além disso, com base no valor de R2 observa-se que omodelo pode explicar uma variação de 89,7%. Assim, os resultados indicam que omodelo obtido foi adequadamente ajustado aos dados experimentais, podendo serutilizado para predizer o CFT em diferentes condições de extração estudadas.

Para investigar os efeitos de interação entre as variáveis na extração de CFT, foigerado um gráfico de superfície de resposta (FIGURA 1). A análise indicou que existe uma faixa ideal deconcentração de etanol para a máxima recuperação de CFT, devido ao efeito quadráticonegativo e significativo apresentado por essa variável. Um aumento no teor de CFTfoi observado com a elevação na concentração de etanol na faixa de 37,5 a 62,5%,sendo que a partir dessa concentração verificou-se um decréscimo no CFT (62,5 a 85%v/v).

A proporção soluto: solvente apresentou apenas efeito linear positivo esignificativo, indicando que um aumento na proporção de solvente em relação aosoluto promove aumento proporcional na extração dos CFT da casca de cupuaçu,conforme observado na FIGURA1.

A análise dos valores ótimos para os parâmetros investigados foi realizada pelametodologia de otimização simultânea, empregando-se a função de desejabilidadeconforme a FIGURA 2.

A concentração de etanol foi igual a 50% (valor codificado = 0) e a proporção daamostra em relação ao solvente foi 1:102 (m/v), como valores apontados pela funçãode desejabilidade como os que fornecem melhor razão sinal/ruído (nesse caso, igual a19,311) e a desejabilidade global igual a 1,00. A partir dessa avaliação foirealizada a validação experimental do modelo matemático obtido por meio de ensaiosem triplicata com o meio otimizado pelo planejamento experimental, onde as condiçõescríticas da concentração de etanol foram de 50 % (v/v) e a proporção soluto:solvente foi de 1:102 m/v a 37°C por 1 h em banho de ultrassom assistida. A médiados valores reais dos CFT da validação experimental foi de 18,08 ± 2,37, muitopróxima ao valor predito pelo modelo matemático nas condições otimizadas que foi de19,31 ± 3,64 µg de EAG/mg de farinha de casca de cupuaçu, confirmando que o modeloobtido foi capaz de prever satisfatoriamente o conteúdo de CFT extraídos.

Concentrações de etanol são determinantes para a extração dos compostos fenólicosdevido à polaridade dos solventes, alterando-a, se promove uma maior extração doscompostos fenólicos presentes na matriz das plantas[20]. Concentrações inferiores a 25% são relatadas emoutros trabalhos de frutas tropicais[21,22], enquanto nesteos valores variaram entre 6,90 e 16,20 µg GAE/mg a depender da razão entre soluto esolvente. Outros trabalhos relatam altas concentrações do solvente para as extraçõesdo cupuaçu[23,24], e neste trabalho as concentrações variaram de6,76 a 16,57 µg GAE/mg, indicando que para a extração de compostos fenólicos dacasca da fruta de cupuaçu, o aumento da apolaridade representa um leve aumento, de0,37 µg GAE/mg, do teor desses compostos no extrato. Extrações utilizando o etanol50% são frequentes no preparo de extratos vegetais com o interesse em prospectarcompostos fenólicos[25,26], no presente trabalho, essaporcentagem de etanol levou uma variação de CFT de 6,26 a 19,00 µg GAE/mg, sendo aproporção que se encontrou a melhor extração dos CFT da casca do cupuaçu. Nesseprocesso, essa matriz vegetal apresenta um perfil polar mais favorável para se obteruma extração otimizada dos compostos fenólicos.

No quesito razão entre soluto e solvente, valores com menores proporções apresentaramos maiores teores desses compostos bioativos, indicando que a maior quantidade desolvente favorece a solubilização evitando que haja uma saturação do meio[27]. O crescimento dessa bioatividadeao decorrer do aumento da razão, também é relatado por outros trabalhos analisandooutras frutas[20,28].

O delineamento experimental utilizado neste trabalho para calcular a proporção erazão para a extração de compostos fenólicos, não apenas mostrou ser eficiente, comoem comparação com os resultados de outro trabalho para a casca do cupuaçu[25] que usou a razão 1:8(soluto: solvente) com dois diferentes solventes, o metanol-acidificado (50%) e aacetona (70%), o valor otimizado nesta pesquisa mostrou-se 87% mais eficiente do queo encontrado em literatura. Já outro trabalho[21], utilizando a casca e sementes, com a proporção de 1:10(soluto: solvente) em etanol 12% demonstrou ser significativamente mais eficientepara essa matéria-prima. Um estudo[22] utilizando a razão 1:5 (soluto: solvente) e etanol 20% relatamum teor de 7,4 µg GAE/mg, demonstrando menos eficiente, o que reforça o fato de queuma alta razão desfavorece a solubilização desses compostos, como previamenterelatado.

O resíduo demonstrou ser uma fonte rica de compostos com grande importância biológicacomo os flavonoides e taninos, além de uma alta atividade antioxidante (TABELA 4). Em relação aosflavonoides, os valores expressos são maiores para o resíduo do que relatado portrabalhos com a polpa ou licores do cupuaçu[22,25], bem como suaatividade antioxidante[23-30]. Quando comparado a outrostrabalhos com frutas tropicais, os valores de CFT e potencial antioxidante sãopróximos, como é o caso do caju, caimito, goiaba, mamão papaia, e outros[26,31].

Comparando os valores otimizados de extração com trabalhos que envolvem aquantificação de compostos bioativos na polpa do cupuaçu[32,33] épossível observar que uma parte considerável da atividade antioxidante desse frutoestá na casca, justificando seu uso comercial nas indústrias de alimentos,cosméticos, chocolate e bebidas [9]. Além disso, foi possível também verificar uma correlação diretaentre compostos fenólicos e atividade antioxidante presente no resíduo.

Foi possível extrair os compostos fenólicos da casca de cupuaçu por ultrassomassistida, utilizando o método DCCR, o qual foi eficiente na avaliação e naotimização da extração dos compostos fenólicos, sendo influenciado tanto pelaconcentração de etanol, como pela proporção de amostra e solvente na extração.