Este trabalho teve como objetivo realizar o estudo químico dos extratos de folhas e galhos de Diplotropis purpurea (Rich.) Amshoff (Fabaceae) e avaliar o seu potencial antiangiogênico. Folhas e galhos foram coletados e extraídos com hexano, metanol (MeOH) e água (H2O), estes foram submetidos à partição e geraram as fases diclorometano (DCM), acetato de etila (AcOEt) e hidrometanólica (MeOH/H2O). Do fracionamento da fase AcOEt das folhas (FofAcOEt), foram isolados o lupeol, a mistura de b-sitosterol e estigmasterol e quercetina. Quanto à atividade antiangiogênica, os extratos e as fases foram avaliados in vivo pelo método da membrana corioalantoica (MCA) de ovos de galinha. O extrato metanólico das folhas (ExMeOHFo), o extrato aquoso (ExH2OGa) e metanólico dos galhos (ExMeOHGa), bem como FofAcOEt apresentaram elevada atividade antiangiogênica, mostrando acima de 70% de inibição na formação de novos vasos sanguíneos. As substâncias foram testadas e a mistura de b-sitosterol e estigmasterol, na concentração de 1000 mg/mL, foi altamente tóxica, levando o embrião a morte, enquanto a quercetina mostrou-se pró-angiogênica. Este trabalho contribuiu para o conhecimento biológico e químico da espécie D. purpurea e da família Fabaceae, sendo este o primeiro relato da atividade antiangiogênica para a espécie em estudo.

A angiogênese é definida como a formação de novos vasos sanguíneos a partir de células endoteliais, e está envolvida em diversos processos naturais como desenvolvimento de órgãos, cicatrização, processos inflamatórios, menstruação, ovulação, formação do corpo lúteo, nidação, morfogênese e envolve uma série de etapas1,2.

A angiogênese é um passo crucial no crescimento, progressão e metástase de tumores, pois os vasos sanguíneos mantêm os tumores oxigenados e alimentados. Logo, a inibição da angiogênese é percebido como uma das mais promissoras estratégias no tratamento de câncer2,3. Processo contrário à angiogênese, a antiangiogênese é fundamental para o equilíbrio das funções teciduais, é o processo de inibição da neoformação vascular. O controle da formação de novos vasos sanguíneos, regula a quantidade de oxigênio nos tecidos, evitando a formação de radicais livres, que podem ser nocivos ao tecido4.

A terapia antiangiogênica busca por novas substâncias, sintéticas ou naturais, capazes de inibir ou bloquear a neovascularização, diminuindo a progressão do tumor e aumentando a expectativa de vida do paciente. Substâncias oriundas de plantas são usadas a muito tempo no tratamento do câncer, como por exemplo os alcaloides da Vinca rosea (vincristina) ou paclitaxel (Taxol) são frequentemente utilizados na oncologia como potentes quimioterápicos ou como um modelo para a síntese de novas drogas5.

O ensaio em membrana corioalantoica de embrião de galinha (CAM), é um modelo in vivo, simples e de baixo custo, que possibilita o estudo do processo complexo da proliferação e migração tumoral. A presença de colágeno do tipo I e integrina avb3, faz com que o ambiente fisiológico se assemelhe ao tumoral2. Outra vantagem do ensaio com a CAM é a gama de materiais que podem ser utilizados como veículos, como, por exemplo, discos de papel filtro, agarose, metilcelulose, poliacrilamida ou colágeno, um polímero natural onde o tecido vascular pode crescer facilmente3.

Conhecida popularmente como fava, sucupira, sucupira-preta, sebipira entre outros, Diplotropis purpurea (Rich.) Amshoff (Fabaceae) é uma árvore de grande porte, amplamente distribuída na Amazônia, característica de Terra Firme, podendo ser encontrada no Brasil, Bolívia, Colômbia, Equador, Guiana Francesa, Peru e Venezuela6,7. Na medicina popular, é usada na forma de uma pasta feita da mistura das sementes raladas com enxofre para o tratamento de impigem7.

Sua madeira é forte e resistente ao ataque de fungos, é muito usada na construção. Há apenas um relato na literatura onde foi realizado um estudo dos constituintes químicos das cascas do tronco, com o isolamento dos esteroides b-sitosterol e estigmasterol, o triterpeno lupeol, o pterocarpano (-)-maackiain [(6aR,11aR)-3-hidroxi-8,9-metilenodioxipterocarpano], formononetina, liquiritigenina, isoliquiritigenina (4,2’,4’-trixidroxiflavona)8. E dos galhos foram isolados os triterpenos lupeol, taraxerol e b-amirina9.

Neste contexto, este trabalho teve como objetivo realizar o estudo químico dos extratos MeOH e H2O das folhas e galhos, e das substâncias isoladas de D. purpurea e avaliar o seu potencial antiangiogênico.

Folhas e galhos de D. purpurea foram coletados na Reserva Particular do Patrimônio Florestal (RPPN) Cachoeira da Onça, Presidente Figueiredo, AM em junho de 2012. A exsicata foi identificada pelo Prof. Dr. Valdely Kinupp e depositada no Herbário do Instituto Federal do Amazonas – IFAM, sob o número: 11230. Folhas e galhos foram secos à temperatura ambiente durante 7 (sete) dias, e moídos em moinho de facas. Estes foram extraídos com Hexano, metanol (MeOH) e água (H2O) em banho de ultrassom por 20 minutos, esse procedimento foi repetido por 3 (três) vezes para cada solvente. Os extratos feitos com solvente orgânico foram concentrados em evaporador rotativo, e o aquoso foi seco em liofilizador.

O extrato MeOH das folhas (8 g) foi submetido à partição com solventes em ordem crescente de polaridade, resultando em três fases: CH2Cl2 (300 mg), AcOEt (3 g) e MeOH/H2O 1:1 (4,49 g). Fase AcOEt das folhas de D. purpurea foi dividida em três partes, e cada uma destas foi fracionada de forma diferente. A primeira parte, cerca de 3,5 g da fase AcOEt, foi fracionada em coluna aberta de Florisil usando o sistema DCM/AcOEt, na análise das frações por CCDC observou-se o indício de substâncias apolares, com bandas roxas em anisaldeído sulfúrico. A subfração Dp1.1-18 foi submetida a tratamento cromatográfico em Poliamida e eluída com misturas de MeOH/AcOEt/Hexano, a subfração de 2.3-11 (32 mg), foi purificada em coluna de sílica e eluidas com misturas de Hexano/DCM/MeOH, de onde foram obtidos o lupeol e a mistura de b-sitosterol e estigmasterol. Uma parte da fase AcOEt foi submetida a uma nova partição com DCM 100%, gerando duas novas fases, que foram codificadas como 1, correspondente à fração apolar, e 2, à fração polar. A porção apolar foi fracionada em sílica e as frações obtidas desta coluna foram submetidas à análise por CLAE-UV/DAD monitorando em 254, 280 e 365 nm. Com auxílio do HPLC e EM, foi possível identificar a substância quercetina.

Os espectros de RMN das substâncias foram obtidos em equipamento Bruker BioSpin AG, modelo Fourier 300 Ultrashield, 300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C, as frações foram analisadas por RMN de 1H e de 13C mono e bidimensionais, utilizando na dissolução das amostras em solvente deuterado apropriado com TMS como padrão. Os deslocamentos químicos (d) foram expressos em partes por milhão (ppm) e as constantes de acoplamento em Hz. Os espectros de massas foram realizados em Espectrômetro de Massas, da marca Bruker Daltonics. E os espectros de UV foram obtidos através de HPLC-UV/DAD –Shimadzu®.

A avaliação da atividade antiangiogênica foi realizada conforme Falcão-Bücker10, baseada na metodologia descrita11. Para a realização destes experimentos foram utilizados ovos de galinha fertilizados (FC Cabocla III) adquiridos na Universidade Federal do Amazonas (UFAM). Ovos fertilizados foram postos em uma incubadora automática e digital (Chocmaster®), na posição horizontal, à temperatura de 37,5 °C e sob umidade relativa do ar de 33%. Após 48 h de incubação, uma pequena janela de 5 mm de diâmetro foi aberta na casca, na região onde se localiza a câmara de ar do ovo para que uma quantidade de aproximadamente 3 mL de claras seja retirada para inibição da aderência dos embriões nas membranas ovulares. A quantidade de ovos é sempre em triplicata para cada tratamento e controles. Outra janela de 15 mm de diâmetro também foi aberta na região do ovo posicionada acima da região da membrana corioalantoica dos embriões, sendo após fechadas com fita isolante de cor preta para minimizar a perda de umidade. Os embriões permaneceram assim, sob incubação, por mais 72 h até a idade embrionária de 6 dias, quando um disco de metilcelulose (1,5%) embebido com 10 µL de extratos nas concentrações de 1000 mg/mL, 500 mg/mL e 100 mg/mL diluídos com álcool etílico foram implantados sobre os vasos sanguíneos no terço externo da membrana corioalantoica. O orifício foi novamente fechado com a mesma fita. A incubação prosseguiu por mais 48 h, até a idade embrionária de 8 dias. Para análise da atividade antiangiogênica a fita foi retirada e os dados referentes ao desenvolvimento embrionário e vascular na região de implantação do disco foram registrados com uma câmera fotográfica para posterior contagem de vasos sanguíneos que interceptam o disco e vasos presentes na vizinhança em uma área de 0,9 cm2. Os resultados foram expressos como percentual de vasos ± desvio-padrão.

Nesta etapa foram avaliados os rendimentos de cada extrato de folhas e galhos de D. purpurea. Para a otimização do processo de extração, foi utilizado o método de cavitação por ultrassom, e a escolha dos solventes extratores foi feita considerando a afinidade das substâncias de interesse com os solventes selecionados. Após obter-se o extrato seco, calculou-se o rendimento total dos extratos, de acordo com a fórmula: Re = (Pext /PMV) x 100, onde: Re = Rendimento total do extrato (%); Pext = Peso do extrato seco (g); PMV = Peso do material vegetal seco e moído (g). Os resultados obtidos estão dispostos na TABELA 1.

As substâncias isoladas da fase AcOEt das folhas (FofAcOEt) de D. purpurea (FIGURA 1) foram: lupeol, e a mistura de b-sitosterol e estigmasterol e quercetina. Lupeol, e a mistura de b-sitosterol e estigmasterol foram e identificadas por meio de comparação com padrões por CCDC, onde as substâncias foram reveladas com anisaldeído sulfúrico e sulfato cérico, mostrando coloração roxa e marrom e RF’s idênticos aos padrões quando eluidas com DCM 100%.

A confirmação veio por meio da análise dos espectros de RMN de 1H e comparação com dados da literatura12 (TABELA 2).

A quercetina, foi identificada por meio de comparação com padrões por CCDC-FR, onde a substância foi revelada com NP/PEG mostrando coloração amarela e RF’s idênticos ao padrão quando eluída em AcOEt 100%. Foi então analisada por CLAE e com o auxílio do detector DAD foi verificado que o espectro na região UV para o pico eluído em tr= 29,47 min em 280 nm, era compatível com o de flavonoide, revelando valores lmax de 199,264 e 360 nm, característico de flavonoides, que apresentam a Banda II com os máximos na faixa espectral de 240 – 280, atribuída ao anel A e da Banda I, com os máximos na faixa espectral de 350 – 385 (intensa) atribuída ao anel B15. Para a confirmação da estrutura foi obtido o espectro de massas em alta resolução usando a técnica ESI-EM de alta resolução, no modo negativo, o composto majoritário presente na fração Dp3.4-5 revelou um valor de m/z 301,0345 u condizente com o aduto [M-H]- C15H9O7. Os dados foram comparados com a literatura e foi possível confirmar a presença de quercetina16.

Os extratos vegetais têm a capacidade de interferir na neovascularização e inibir ou induzir a formação de novos vasos sanguíneos, o que é crucial na supressão do crescimento de tumores, por isso o ensaio de atividade antiangiogênica dos extratos vegetais tem despertado grande interesse na comunidade científica devido ao seu potencial terapêutico. Uma grande quantidade de estudos destaca que compostos bioativos presentes em extratos de plantas medicinais, tais como flavonoides e polifenóis, são agentes-chave nesse processo. A compreensão desses mecanismos abre caminho para o desenvolvimento de novas estratégias no combate ao câncer e outras doenças relacionadas à angiogênese desregulada16.

Os extratos metanólico das folhas de D. purpurea (ExMFo) e hidrometanólica (ExMFofHM) provenientes de partição líquido-líquido das folhas de D. purpurea foram testadas quanto à atividade antiangiogênica e mostraram alto potencial angiostático, principalmente na concentração de 1000 mg/mL, onde houve inibição de até 80% da formação dos vasos sanguíneos, indicando que esta atividade está ligada às substâncias de maior polaridade presentes nas folhas (FIGURA 2).

A amostra ExMGa (FIGURA 3) de D. purpurea mostrou alto potencial angiostático, principalmente na concentração de 1000 mg/mL, onde houve inibição de até 80% da formação dos vasos sanguíneos. E na concentração de 500 mg/mL o resultado ficou bem próximo, em torno de 78% de inibição.

Na literatura foi registrado o isolamento dos triterpenos: lupeol, taraxerol e b-amirina; dos esteroides: b-sitosterol, estigmasterol; das flavonas formononetina, (-)-maackiain, 7-hidroxiflavona, liquiritigenina e isoliquiretigenina8,9. Buscas em bancos de dados e na literatura, apontam que estas substâncias foram extensivamente estudadas e são apontadas como antioxidantes, anti-inflamatórias, reguladores hormonais, neuroprotetoras, além de proteger o DNA de danos oxidativos e diminuir as taxas de LDL, o que as tornam grandes aliadas na luta contra variados tipos de câncer15,17.

Os terpenos lupeol, e a mistura de b-sitosterol e estigmasterol mostraram alta atividade antiangiogênica (FIGURA 4). O triterpeno lupeol inibiu cerca de 70% do crescimento dos vasos sanguíneos na concentração de 1000 mg/mL. Já a mistura de esteroide estigmasterol e b-sitosterol mostrou-se altamente tóxica, causando a morte do embrião na concentração de 1000 mgmL.

Os compostos fenólicos, possuem diversas atividades, entre elas destaca-se a inibição da produção de VEGF (fator de crescimento endotelial), um peptídeo angiogênico, que estimula a neoformação vascular necessária para o desenvolvimento tumoral, como é o caso da epigalocatequina acetato, que inibe a liberação de VEGF, que ao ficar estocado nas células, não permite a formação de novos vasos. O campferol e outros flavonoides também diminuem a síntese de VEGF, contribuindo para a atividade antiangiogênica do extrato3,16.

Há vários estudos na literatura apontando o potencial anti-inflamatório, antitumoral, sobre atrite, diabetes, doenças coronárias e toxicidade renal e hepática para os dois, e estudos recentes mostram que o lupeol atua diretamente na indução de apoptose, tanto in vitro quanto in vivo18. No estudo realizado por Kangsamaksin et al.18, estigmasterol e lupeol inibiram a angiogênese em tumores em modelo de xenoenerto em colangiocarcinoma in vivo usando ratos wistar, e não apresentaram toxicidade em mamíferos, ressaltando o potencial antitumoral dessas duas substâncias que são amplamente difundidas na natureza17.

A quercetina é um flavonol amplamente distribuído na natureza, para o qual já foram relatadas as atividades antioxidante, anti-inflamatória e de quimioprevenção. Em outros trabalhos, foi relatada a sua atividade antiangiogênica3, no entanto, neste trabalho, foi constatada a atividade angiogênica em todas as concentrações testadas.

A espécie D. purpurea, rica em compostos fenólicos, mostrou-se promissora como agente antitumoral, no entanto, mais estudos precisam ser realizados. O extrato metanólico das folhas e os extratos aquoso e metanólico dos galhos, bem como a fase AcOEt apresentaram alta atividade antiangiogênica, acima de 70% de inibição na formação de vasos. Das três substâncias testadas (mistura de b-sitosterol e estigmasterol, lupeol e quercetina) o estigmasterol 1000 mg/mL foi altamente tóxico, levando o embrião à morte, enquanto a quercetina mostrou-se angiogênica.