Avaliação química e microbiológica do óleo essencial de Cymbopogon densiflorus (Poaceae)

Resumo

A espécie Cymbopogon densiflorus, conhecida popularmente como capim caboclo, capim nagô é tradicionalmente utilizada contra resfriados, asma e infecções é originária da África e bem aclimatada no Brasil. O objetivo deste trabalho foi identificar os principais compostos do óleo essencial da inflorescência de C. densiflorus e avaliar sua atividade antimicrobiana frente a microrganismos patogênicos humanos. O óleo foi obtido por hidrodestilação em aparelho Clevenger modificado por 2 h. As amostras foram caracterizadas por cromatografia gasosa e os principais compostos identificados foram monoterpenos, ésteres de ácido graxo, álcoois e óxidos, sendo o limoneno o constituinte presente em maior quantidade (13,07%). A análise da atividade microbiológica do óleo essencial em diferentes concentrações (100%, 50% e 25%) evidenciou sua capacidade antimicrobiana avaliada pela efetividade na inibição do crescimento dos microorganismos, Bacillus sp., S. aureus, E. coli indicado por meio da formação de halos de inibição do crescimento com diâmetro igual ou superior a 10 mm. Estudos futuros são requeridos a fim de se investigar o potencial terapêutico e econômico do óleo de C. densiflorus para o tratamento de doenças microbianas como pneumonia, infecçoes cutâneas, Gastroenterite, cistite que acometem a população.

Palavras-chave:

Cymbopogon.

Óleos Voláteis.

Antimicrobiano.

Fitoterapia.

Abstract

The Cymbopogon densiflorus species, popularly know as caboclo grass, nagô grass, traditionally used against colds, asthma and infections originates in Africa and is well acclimatized in Brazil. The objective of this work was to identify the main essential oil compounds of the inflorescence of C. densiflorus and to evaluate its antimicrobial activity against human pathogenic microorganisms. The oil was extracted by hydrodistillation in Clevenger apparatus modified for 2 h. The samples were characterized by gas chromatography and the main compounds identified were monoterpenes, fatty acid esters, alcohols, and oxides, with limonene being the major constituent (13,07%). The microbiological analysis of the essential oil in different concentrations (100%, 50% and 25%) evidenced its antimicrobial capacity evaluated by the effectiveness in inhibiting the growth of microorganisms Bacillus sp., S. aureus, E. coli indicated by means of formation of growth inhibition halos with a diameter equal to or greater than 10 mm. Future studies are required to investigate the therapeutic and economic potential of C. densiflorus oil for the treatment of microbial diseases that affect the population.

Keywords:

Cymbopogon.

Volatile Oils.

Anti-Infectious.

Phytotherapy.

Introdução

As doenças causadas por microrganismos possuem grande impacto na saúde da população, pois se propagam com facilidade e seus agentes causadores adquirirem comumente resistência a antimicrobianos^[1].

O interesse por plantas medicinais surge da necessidade em diminuir os problemas ocasionados por microrganismos patogênicos, levando a uma nova abordagem terapêutica^[2], menos agressiva ao organismo e que possui maior disponibilidade de acesso para a população^[3].

Dentre as plantas medicinais usadas pela população encontram-se espécies do gênero Cymbopogon sp. pertencentes à família Poaceae, cuja característica marcante é a aromaticidade, proveniente dos óleos essenciais, conhecidos também por suas marcantes atividades antimicrobianas^[4].

O gênero Cymbopogon pertence à família Poaceae e possui cerca de 40 espécies, distribuídas em regiões tropicais e subtropicais. Originário da África, no Brasil cresce nos cerrados da Bahia, Brasil Central e Sudeste^[5]. É perene e mede entre 0,7 e 2 m contendo folhas distribuídas ao longo dos colmos. As inflorescências podem chegar a 26 cm, contraídas^[5,6]. É conhecido popularmente como capim caboclo, capim nagô ou capim marinho (FIGURA 1).

Estudos sobre o óleo essencial das folhas desta espécie indicam os monoterpenos como os principais constituintes e responsáveis por suas atividades terapêuticas^[7].  A forma de preparo tradicional relatada na literatura é por meio de chás, lambedores e garrafadas^[8], comumente utilizado contra resfriados, asma, febre, epilepsia, dores abdominais, infecções do trato respiratório e repelente de insetos^{[9,10,7,11,12]}.

Os óleos essenciais, são produtos obtidos de plantas, a partir da destilação por arraste com vapor d`água ou expressão dos pericarpos de frutos cítricos^[13]. São sintetizados em estruturas denominadas tricomas glandulares e quimicamente constituídos por fenilpropanóides e/ou terpenóides ^[14].

A composição química diversa dos óleos voláteis pode ser influenciada por fatores como: órgão da planta onde este é armazenado, solo, clima, ciclo de vida da espécie vegetal, índice pluviométrico, luminosidade^[7,15,16], entre outros.

A extração por hidrodestilação promove o contato direto entre a água aquecida e a matéria prima vegetal. Os componentes voláteis são arrastados pelo vapor d'água até chegarem a um condensador onde retornam ao estado líquido^[13]. Este procedimento permite que o óleo seja adquirido em pequena escala, empregando-se aparelho de Clevenger, o óleo obtido é recolhido, separado da fase aquosa e as duas partes trabalhadas separadamente^[17]. Seu rendimento é influenciado por fatores como o tempo, método de extração, fatores ambientais no momento da coleta, cultivo, além dos fatores genéticos do vegetal^[18,19].

Os óleos essenciais vêm sendo cada vez mais estudados por apresentarem um amplo espectro de ações importantes na terapêutica, como por exemplo, ação antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatória, antiviral^[9,11,20-22].

O presente trabalho teve por objetivo identificar, caracterizar quimicamente os principais compostos do óleo essencial da inflorescência de Cymbopogon densiflorus e avaliar sua atividade antimicrobiana frente a microrganismos patogênicos humanos.

Materiais e Métodos

Obtenção das amostras

A espécie Cymbopogon densiflorus foi coletada nas dependencias da Chácara Sarah- El, SH Águas Quentes, Recanto das Emas, 15°56'35.5"S 48°13'25.7"W (FIGURA 1) e a exsicata da mesma está localizada no herbário da Universidade de Brasília sob registro Fagg cw 2411 (UB) para C. densiflorus (Steud) Stapf. O óleo essencial foi extraído pelo método de hidrodestilação em aparelho de Clevenger modificado, por 2 horas.  O hidrolato obtido foi centrifugado, utilizando centrífuga de bancada analógica Novainstruments^® a 3800 rpm por 20 minutos. O óleo obtido foi separado, armazenado em tubos de vidro e estocados em temperatura 5±3ºC, protegidos da luz.

Análise por Cromatografia Gasosado óleo essencial

As amostras foram caracterizadas por cromatografia gasosa de alta resolução (CG-FID) por um cromatógrafo a gás HP 7820A (Agilent^®). Coluna: Rxi-5MS 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm (Restek^®). Temp.: Coluna: 50°C (5min), 3°C /min, até 220°C. Injetor: 230°C Split (1:30). Detector FID: 250°C. Gás de arraste: H2 a 4 ml/min. Vol. de injeção: 1.0 µl. Software de aquisição de dados: EZChrom Elite Compact (Agilent^®) e por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG- EM) em um equipamento GCMS-QP2010 ULTRA (Shimadzu^®). Coluna: Rxi-5MS 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm (Restek^®). Temperatura da coluna: 50°C (5min), 3°C /min, até 220°C. Injetor: 230°C Split (1:30), Interface CG-MS a 250°C. Detector MS (Impacto eletrônico a 70eV) a 250°C. Gás de arraste: Hélio a 3.0 ml/min. Vol. de injeção: 1.0 µl. Software de aquisição de dados: GCMS Solution (Shimadzu^®) no Laboratório de Cromatografia, Departamento de Química da UFMG.

Análise microbiológica

As amostras de óleo essencial extraídas foram submetidas a testes de atividade antimicrobiana por disco difusão (antibiograma) conforme M7-A6, NCCLS(National Committe for Clinical Laboratory Standards) para os microorganismos patogênicos gram positivos Staphylococcus aureus, ATCC 6538, Bacillus sp., gram negativa Escherichia coli, ATCC8739 e Candida albicans, ATCC 10231.

Foi utilizado para o crescimento de Staphylococcus aureus (S.aureus), Bacillus sp. Escherichia coli (E.coli) o meio de cultura Luria Betani (LB), Acumedia^®  e para levedura o meio Yeast extract Peptone Dextrose (YPD). Os microorganismos foram inoculados em meio líquido e levados a incubadora NT 715 Shaker^® para crescimento por ±18 h a 37ºC.  Após o crescimento dos microorganismos as células foram contadas em câmara de Neubauer e o número de células/mL foi padronizado por meio da fórmula^[23]:

O número de células foi padronizado em 1,5x1016 cel/mL . Foram inoculados 200µL do inóculo em meio com LB ágar, Acumedia^®  para S. aureus, E. coli e Bacillus sp. e YPD ágar, Acumedia^® para C. albicans. Sobre o meio foram inseridos discos de papel de filtro, separados em  6 quadrantes de forma equidistantes. Sobre os discos foram aplicados 1,25 µL de diferentes concentrações da amostra 100% (v/v) (1), 50% (v/v) (2), 25% (v/v) (3), e os controles positivo (4) utilizando cloranfenicol frente à Bacillus sp. na concentração de 130 µg/mL, S. aureus (30µg/mL), E.coli (64 µg/mL) e nistatina para C. albicans (32 µg/mL).

Como controle negativo foram utilizados o disco com (5) e sem (6) o solvente hexano, Dinâmica^®. As amostras  foram diluídas em Hexano, Dinâmica^® e as análises realizadas em triplicata sendo o halo de inibição medido (mm).

Resultados e Discussão

O rendimento do óleo essencial é dependente de diversos fatores ambientais, como o clima, o solo, a época do ano em que a amostra é coletada, local em que a planta se devenvolve e parte da planta utilizada^[19]. O óleo essencial obtido a partir da inflorescência de C. densiflorus apresentou rendimento de 1,44% em relação ao peso seco, enquanto o óleo essencial obtido a partir da folha de C.densiflorus não obteve rendimento significativo, desta forma não obteve-se quantidade suficiente para permitir a viabilidade dos testes durante a elaboração desta análise. Acredita-se que a diferença resultante é devido a composição química presente em folhas em flores, por possuir uma maior concentração e armazenamento dos óleos essenciais nas flores do que nas folhas^[11].

A caracterização química do óleo essencial de C. densiflorus realizada por cromatografia gasosa de alta resolução acoplada a espetrômetro de massas permitiu identificar os compostos que apresentaram índice de similaridade maior que  90% com a biblioteca do equipamento.

Os compostos observados foram os álcoois monoterpênicos, como cis-carveol (7,46%), trans-p-menta-2,8-dienol (12,17%), p-menta-6,8-dien-2-ol (3,38%), 4-isopropenil-1-metil-2-ciclohexen-1-ol (4,33%), 4-Isopropenil-1-metil-1,2-ciclohexanediol (2,61%). Éster de ácido graxo isoamil caproato (0,46%), utilizado em grande maioria como flavorizante de produtos alimentícios^[24]. O hidrocarboneto monoterpênico, limoneno, constituinte em maior quantidade (13,07%) nas amostras de inflorescência do óleo essencial de C. densiflorus. Óxidos, cis-limoneno óxido (1,08%), trans limoneno óxido (4,98%), (1S, 4R) -p-menta-2,8-dien,1-hidroperóxido (2,94%), 1R, 4R-p-menta-2,8-dien,1-hidroperóxido (1,38%). Monoterpenos cetônicos como a D-carvona (3,13%) e, Alpha-irona (0,88%), presentes  também  em outras espécies vegetais como Mentha arvensis (hortelã), Carum capticum (cominho), Anethum graveolens (endro)sãoconhecidos por sua atividade antioxidante e antimicrobiana^[25] (TABELA 1).

TABELA 1: Classificação e estrutura química dos compostos encontrados no óleo essencial de Cymbopogon densiflorus e outras espécies vegetais que contém compostos químicos semelhantes.

Classificação	Composto químico	Área	Teor (%)	Estrutura química [26]	Espécies vegetais
Hidrocarboneto Monoterpeno	Limoneno	78106995	13,07		Citrus sinensis, Citrus aurantium
Monoterpeno cetônico	D-carvona	8703665	3,13		Mentha spicata, Carum capticum
	Alpha-irona	245205	0,88		Anethum graveolens, Cissus sicyoides
Álcool monoterpênico	cis-carveol	2072654	7,46		Hyptis dilatata, Lippia gracillis
	trans-p-menta-2,8-dienol	33807025	12,17		Zanthoxylum Linnaeus
	p-menta-6,8-dien-2-ol	9394915	3,38		Mentha arvensis, Mentha pulegium
	4-isopropenil-1-metil-2-ciclohexen-1-ol	12025025	4,33		Philodendron solimoesense
	4-Isopropenil-1-metil-1,2-ciclohexanediol	724359	2,61		Struthanthus flexicaulis
Éster de ácido graxo	Isoamil caproato	1281755	0,46		Caryocar brasiliense
Óxidos	cis-limoneno óxido	299296	1,08		Citrus limonum, Citrus aurantium
	trans-limoneno óxido	1384324	4,98		Citrus limonum, Citrus aurantium
	(1S, 4R)-p-menta-2,8-dien,1-hidroperóxido	817791,5	2,94		Chenopodium ambrosioides
	1R, 4R-p-menta-2,8-dien,1-hidroperóxido	382560,6	1,38		Elionurus muticus

A análise microbiológica do óleo essencial em diferentes concentrações (100%, 50% e 25% de óleo) evidenciou a capacidade antimicrobiana do mesmo, conforme é observado na FIGURA 2. O halo de inibição do crescimento dos microorganismos patogênicos utilizados foi medido (em mm) e seus valores registrados, conforme  mostrado na TABELA 2.

Resultados semelhantes foram observados por Seibert^[27], ao avaliar a atividade antimicrobiana do óleo essencial das folhas de C. densiflorus frente à os microorganismos patogênicos E. coli, S. aureus e submetidos à ação do óleo essencial de C. densiflorus. Takaisi-Kikuni et al.^[28]observaram que bactérias Gram positivas foram mais sensíveis do que Gram negativas quando submetidas à avaliação do óleo essencial de flores e folhas de C. densiflorus..

Os resultados obtidos neste trabalho não observaram diferenças de susceptibilidades entre bactérias Gram positivas e Gram negativas, pois ambas apresentam resistência intermediária (≥ 13 mm), conforme os parâmetros de resistência microbiana descritos pelo CSLI (Clinical and Laboratory Standards Institute)^[29] e pode-se perceber que o halo de inibição permaneceu semelhante entre ambas (FIGURA 2).

Os compostos obtidos como limoneno (13,07%), trans-p-menta-2,8-dienol (12,17%) possuem maior concentração de ativo devido sua sintetização ocorrer predominantemente nas inflorescências e ser precursor da síntese de outros terpenos (TABELA 1) e sugerem maior atividade antimicrobiana^[30].

Os resultados observados para C. albicans submetidos à ação do óleo essencial obtido a partir da inflorescência de C. densiflorus foram semelhantes aos observados por Seibert^[27], ao analisar a ação antifúngica do óleo essencial obtido das folhas de C. densiflorus sobre C. albicans.

Conclusão

Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o óleo extraído da inflorescência de C. densiflorus tem potencial ação antimicrobiana frente aos microrganismos patógenos S. aureus, Bacillus sp. C. albicans e E. coli, o que também é sugerido em sua avaliação química pela presença de compostos com comprovada ação antimicrobiana. Entretanto, estudos futuros são requeridos, a fim de se investigar melhor seu potencial terapêutico como antimicrobiano, antifúngico e econômico para o tratamento das doenças microbianas que acometem a população.

Agradecimentos

À Universidade de Brasília.

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