Caracterização fitoquímica e avaliação da atividade antioxidante de Dipteryx alata Vogel (Fabaceae)

Resumo

Estudos têm demonstrado algumas propriedades biológicas associadas a Dipteryx alata Vogel (Fabaceae), espécie típica do cerrado. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi caracterizar os constituintes fitoquímicos e analisar a atividade antioxidante do extrato etanólico das folhas e polpa do Baru. As folhas e frutos foram coletados aleatoriamente de 10 indivíduos, no município de Arinos (MG). Os compostos químicos do extrato etanólico foram analisados por meio de reações químicas descritas em protocolo específico. O teor de compostos fenólicos foi quantificado, por meio de espectrofotometria. Além disso, foi utilizado o método de redução do DPPH para avaliação da atividade antioxidante. Os resultados revelaram alta atividade antioxidante e elevado teor de compostos fenólicos nas folhas do Baru, enquanto na polpa os valores foram mais baixos. O resultado obtido com o extrato da folha do Baru indica um grande potencial antioxidante, e estudos adicionais podem ser realizados a fim de isolar os compostos responsáveis por essa atividade na planta.

Palavras-chave:

Baru.

Compostos fenólicos.

DPPH.

Folha.

Polpa.

Abstract

Studies show some biological properties associated with Dipteryx alata Vogel (Fabaceae), a typical species from Cerrado. Therefore, this work aimed to characterize the phytochemical compounds and analyze the antioxidant activity of the ethanolic extracts from the leaves and pulp of Baru. The leaves and fruits were collected randomly from ten individuals, in the city of Arinos (MG). The chemical compounds of the ethanolic extracts were analyzed by chemical reactions described in specific protocols. The content of phenolic compounds was quantified by spectrophotometry. Furthermore, the DPPH reduction method was used to verify the antioxidant activity. The results revealed a high antioxidant activity and a high content of phenolic compounds in Baru leaves, meanwhile in the pulp the values were lower. The obtained results with leaves and pulp extracts from Baru indicate a great antioxidant potential and additional studies should be performed to isolate the compounds, which are responsible for this activity in the plant.

Keywords:

Baru.

Phenolic compounds.

DPPH.

Leaves.

Pulp.

Introdução

O Cerrado é o segundo maior bioma da América do Sul, com uma área de 2.036.448 km2, que ocupa cerca de 22% do território nacional. É considerado um dos hotspots mundiais de biodiversidade e reconhecido como a savana mais rica do mundo, pois abriga 12.070 espécies de Angiospermas nativas^[1]. Além dos aspectos ambientais, o cerrado tem grande importância social, uma vez que muitas populações sobrevivem de seus recursos naturais^[2]. O estudo da sua biodiversidade pode auxiliar na seleção e preservação de espécies de elevado valor nutritivo e contribuir para a garantia da segurança alimentar e nutricional, por meio da promoção do consumo de alimentos regionais^[3].

Dentre as diversas espécies do bioma Cerrado encontra-se Dipteryx alata Vogel, popularmente conhecida como Baru. A referida espécie pertence à família Fabaceae (Leguminosae), subfamília Faboideae. É nativa, mas não endêmica do Brasil, ocorrendo no norte, nordeste e sudeste do Brasil, além de países vizinhos como Paraguai, Peru e Bolívia. Apresenta altura média de 15 metros, com tronco de cor cinza clara ou creme, que pode ser liso ou apresentar placas de formato irregular. As folhas são alternas, compostas pinadas, pecioladas, sem estípulas e raque alada, que originou o nome da espécie^[4]. O fruto é do tipo legume drupóide, monospérmico, indeiscente, geralmente ovoide e fibroso^[5].

O Baru é tradicionalmente utilizado no combate à bronquite, diarreia, disenteria, dor de garganta, picada de cobra e como cicatrizante^[6]. Utiliza-se também a entrecasca, folha e a semente do Baru como tônico e em tratamentos de gripe, tosse, artrose, gastrite e anemia^[7]. A amêndoa apresenta alto valor nutritivo e é apreciada como aperitivo ou em inúmeras receitas na forma de pé-de-moleque, paçoca, rapaduras, etc.^[4].

As propriedades medicinais das plantas estão associadas ao papel ecológico desempenhado pelos metabólitos secundários na interação da planta com o ambiente, como proteção contra o ataque de herbívoros, microrganismos, ação alelopática, além de agir como atrativos para animais polinizadores^[8].

As substâncias fenólicas são reconhecidamente detentoras de pronunciada atividade antioxidante, atuando como sequestradoras de radicais livres e como quelantes de metais, despertando, assim, interesse face à possibilidade de serem utilizadas no tratamento de várias doenças degenerativas, bem como envelhecimento precoce, processos inflamatórios, cicatrização, câncer, entre outras^[9]. Estes compostos também estão envolvidos em tratamentos de pigmentação que resultam em hiperpigmentação ou hipopigmentação cutânea^[10].

Sendo assim, este trabalho objetivou caracterizar os constituintes fitoquímicos, quantificar o teor de compostos fenólicos e analisar a atividade antioxidante do extrato etanólico das folhas e polpa do Baru.

Material e Método

Coleta do material botânico

As folhas e os frutos do Baru (D. alata Vogel) foram coletados aleatoriamente de 10 indivíduos, durante os meses de agosto e setembro de 2018, no Instituto Federal do Norte de Minas Gerais – Campus Arinos, localizado na região noroeste do estado de Minas Gerais.

Preparo de extrato etanólico

A polpa (mesocarpo e endocarpo) do fruto do Baru foi retirada com auxílio de faca. As folhas coletadas e a polpa do fruto foram submetidas à secagem em estufa à temperatura de 40ºC (±0,5) por 3 dias. As folhas e as polpas foram trituradas separadamente. Os extratos foram preparados a partir de 100 g do pó das folhas e polpa dos frutos. A extração ocorreu por maceração em 500 mL de solução etanólica 95% durante 7 dias. Após este período os concentrados de folha e polpa foram filtrados com bomba a vácuo. Os filtrados foram concentrados em estufa por 7 dias a 50ºC^[11]. Com auxílio de uma espátula, raspou-se o concentrado obtido da polpa e folha e armazenou-se cada extrato, em geladeira, até o momento da utilização.

Prospecção fitoquímica

Os concentrados obtidos, na extração da polpa e da folha, foram submetidos a uma série de reações de caracterização fitoquímica, conforme Barbosa^[12] e SBFgnosia^[13], descritos a seguir:

1) Teste de alcaloides

Ferveu-se 5 g do concentrado da folha em 30 mL de Ácido clorídrico 2N. Filtrou-se em algodão e dividiu-se o filtrado obtido em 3 tubos de ensaio. Ao 1º tubo acrescentou-se 3 gotas do reativo de Dragendorf e ao 2º o reativo de Bouchardat. O 3º tubo foi o branco. Repetiu-se o mesmo procedimento para o concentrado obtido da polpa. O chá-verde foi utilizado como controle. Observou-se a formação de turvação nos tubos.

2) Teste de Ácidos orgânicos

Dissolveu-se 1 g dos concentrados da polpa e folha em 10 mL de água destilada e filtrou-se. Adicionou-se 5 gotas do reativo de Pascová sobre os extratos da polpa, folha e controle (ácido lático) e observou-se a reação.

3) Teste de açúcares redutores

Dissolveu-se 1 g dos concentrados da polpa e folha em 10 mL de água destilada e filtrou-se. Para identificação da presença de açúcares redutores foi utilizado o reativo de Fehling. Utilizou-se frutose como controle. Os tubos foram colocados em banho-maria fervente por 1 minuto. A formação de precipitado vermelho tijolo indicou a presença de açúcares redutores.

4) Teste de amido

Dissolveu 1 g dos concentrados da polpa e folha em 10 mL de água destilada e filtrou-se. Utilizou-se amido solúvel 1% como controle e água destilada como branco. Sobre 1 mL de cada amostra adicionou-se 4 gotas de solução de Lugol. A mudança de coloração da solução para azul ou preto indicou a presença de amido.

5) Teste de Flavonoides

Dissolveu-se 1 g de cada concentrado obtido a partir da polpa e da folha em 10 mL de solução etanólica 70% e ferveu-se por 2 min. Posteriormente realizou-se a filtragem das soluções, com algodão. Em seguida, colocou-se 2 mL de cada solução em tubos de ensaio e acrescentou-se aos tubos algumas raspas de Magnésio metálico e 1 mL de HCl. A presença de flavonoides foi indicada pela coloração rósea a vermelha.

Quantificação de Compostos Fenólicos

A quantificação do conteúdo de compostos fenólicos, no extrato etanólico da polpa e folha do Baru, baseou-se no método colorimétrico de Folin-Ciocalteu^[14]. O reagente de Folin-Ciocalteu, de coloração amarelo, forma um complexo de coloração azul na presença de agentes redutores, no caso de compostos fenólicos.

Diluiu-se o concentrado da folha em água destilada até a obtenção de uma solução 2 mg/mL. A polpa foi diluída a uma concentração de 20 mg/mL, também em água destilada. Adicionou-se, a cada 0,5 mL de amostra, 0,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteu 2 N e 1,0 mL de água. Após um período de 5 minutos, foi acrescentado aos tubos 0,5 mL de carbonato de sódio (Na2CO3) 10%. Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, a absorbância foi mensurada em espectrofotômetro a 760 nm, usando água destilada como branco. Para elaboração da curva padrão utilizou-se Ácido gálico (5 a 30 μg/mL), dissolvido em água destilada a partir de solução estoque de 100 μg/mL. As análises foram realizadas em triplicata e os valores de fenóis totais foram expressos como equivalentes de ácido gálico (mg de ácido gálico/g de amostra).

Avaliação da Atividade Antioxidante

A atividade antioxidante da polpa e folha foi analisada através do método do sequestro do radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH) ^[15].

Os extratos secos foram solubilizados em etanol 95%, para obtenção de soluções-estoque de 1 µg/µL. Alíquotas das soluções-estoque da polpa e da folha foram adicionadas a 3 mL de solução de DPPH 40μg/mL, diluída em etanol, obtendo-se concentrações finais de 1,7 a 16,7 μg/mL. Utilizou-se, como substância de referência, ácido gálico, testado em cinco concentrações diferentes (0,3 a 1,6 μg/mL). As amostras foram guardadas ao abrigo da luz por 30 minutos, posteriormente realizou-se a leitura das absorbâncias em espectrofotômetro a 515 nm. A solução etanólica de DPPH 40 μg/mL (sem adição de antioxidante) foi utilizada como controle, e como branco utilizou-se etanol absoluto. Os valores de absorbância em todas as concentrações testadas foram convertidos em porcentagem de atividade antioxidante (AA%), determinada pela equação:

% AA = [(Abscontrole – Absamostra)/ Abscontrole] x100

Onde: Abscontrole= absorvância da solução etanólica de DPPH 40μg/mL; Absamostra = absorvância da mistura reacional (DPPH + amostra).

Para a análise dos dados utilizou-se o sistema estatístico SISVAR®, e as médias foram comparadas com teste de Tukey a 5% de probabilidade^[16].

O parâmetro utilizado para avaliar a capacidade antioxidante foi o valor de CE50 (Concentração Eficiente), que indica a concentração necessária para reduzir 50% do radical livre DPPH. Para determinar a CE50 de cada extrato testado foram construídas curvas de regressão (Excel), com porcentagem de atividade antioxidante (eixo Y) em função da concentração µg/mL (eixo X).

Resultados e Discussão

Prospecção Fitoquímica

Dentre os testes realizados, as folhas de Baru apresentaram resultado positivo apenas para flavonoides, enquanto a polpa apresentou somente açúcares redutores.

As espécies de Fabaceae são particularmente ricas em flavonoides e compostos relacionados, como rotenoides e isoflavonoides^[17]. Mas os compostos ativos presentes em cada planta podem variar de acordo com o método de extração e a época da coleta. Estímulos decorrentes do ambiente em que a planta se encontra, podem redirecionar a rota metabólica, ocasionando a síntese de diferentes compostos, modificando assim as características qualitativas e quantitativas do extrato^[18]. Dessa forma, a quantidade e a natureza dos constituintes ativos não são constantes durante o ano. Fatores como temperatura, disponibilidade hídrica, radiação ultravioleta, nutrientes, altitude, poluição atmosférica, entre outros, podem afetar o conteúdo final de metabólitos secundários em plantas medicinais^[19].

Quantificação de fenóis totais

Os resultados da quantificação do conteúdo de compostos fenólicos dos extratos da folha e polpa do Baru foram obtidos a partir da curva padrão de ácido gálico (FIGURA 1). Observou-se um maior teor de compostos fenólicos no extrato da folha (409,5 mgEAG/g), sendo que este foi mais de 2 vezes maior que o observado no extrato da polpa do fruto (194,5 mgEAG/g). Um dos fatores que pode ter contribuído para esta grande diferença observada entre os extratos, pode ser a presença de flavonoides nas folhas do Baru, que não foi detectada na polpa.

O teor de fenóis totais detectado nas folhas do Baru foi quase 4 vezes maior que a concentração obtida para a mesma espécie por Silvério et al.^[10]: 112,3 mgEAG/g. Também foi superior ao observado por Martins^[20] com extrato etanólico de folhas e cascas de Inga laurina (Sw.) Willd. (Fabaceae) (127,7 e 384,5 mgEAG/g, respectivamente). Variáveis como o preparo do extrato, época e local de coleta podem ser os responsáveis por tal diferença.

Idioblastos fenólicos são considerados de ocorrência generalizada em Fabaceae^[21]. Testes histoquímicos revelaram a presença de compostos fenólicos impregnados na parede das células corticais e floemáticas da raiz, bem como no pecíolo e nervura central da folha de Hymenaea martiana Hayne (Fabaceae)^[22].

Os compostos fenólicos englobam desde moléculas simples até outras com alto grau de polimerização^[23]. Estão presentes nos vegetais na forma livre ou ligados a glicosídeos e proteínas^[24]. Essa classe de compostos tem revelado inúmeros benefícios para a saúde por suas atividades antioxidante, anticarcinogênica, antienvelhecimento, anti-inflamatória, antimicrobiana, efeito cardioprotetor e atividade inibitória da melanogênese^[10,25-27].

Atividade antioxidante

O resultado da análise da atividade antioxidante pelo método do DPPH demostrou diferença entre polpa e folha, conforme TABELA 1. Em todas as concentrações, a atividade antioxidante da folha foi superior à da polpa. O resultado da análise da atividade antioxidante da substância de referência (ácido gálico) encontra-se expresso na TABELA 2.

Os gráficos das FIGURAS 3 e 4 foram utilizados para a obtenção da CE50 do extrato da folha e do ácido gálico, respectivamente. A CE50 da substância de referência (ácido gálico) foi 1,13 μg/mL, enquanto a CE50 da folha foi 9,02 μg/mL. Este resultado revela que é necessária uma concentração de 9,02 μg/mL do extrato da folha de Baru para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50%. Não foi calculada a CE50 da polpa, uma vez que sua atividade antioxidante foi muito baixa.

Roesler et al.^[28], ao analisar a atividade antioxidante de frutos do cerrado, apresentaram como melhores resultados os valores de CE50 9,44 e 17,98 µg/mL para os extrato aquoso e etanólico de casca de pequi (Caryocar brasiliense Cambess., Caryocaraceae), respectivamente. E a substância de referência (ácido gálico) apresentou CE50 (1,38 µg/mL), semelhante ao resultado obtido neste trabalho.

O resultado obtido com o extrato da folha do Baru indica um grande potencial antioxidante. Como observado na determinação dos compostos fenólicos, as folhas apresentaram alto conteúdo destes compostos, que podem, portanto, estar relacionados a sua elevada atividade antioxidante. Estudos adicionais podem ser realizados a fim de isolar os compostos responsáveis por essa atividade.

Conforme Roesler et al.^[28], a correlação entre fenóis totais e atividade antioxidante relatada na literatura é contraditória. Enquanto alguns autores observaram uma alta correlação, outros não observaram correlação direta. Essa correlação pode depender do método empregado, das características hidrofóbicas ou hidrofílicas do sistema teste, e dos antioxidantes testados.

Os antioxidantes inibem a oxidação de substratos, por meio de dois mecanismos: inibição da formação ou eliminação dos radicais livres, por meio da doação de átomos de hidrogênio a estas moléculas. Antioxidantes fenólicos podem agir nos dois mecanismos^[29].

Nos últimos anos, os radicais livres vêm sendo discutidos devido a sua capacidade de desestabilizar biomoléculas como carboidratos, lipídios, proteínas e DNA, causando doenças degenerativas, artrite, inflamação, envelhecimento precoce, câncer e problemas cardiovasculares^[30]. Apesar do elevado potencial antioxidante apresentado por testes in vitro, Soares^[29] ressalta que é de extrema importância o estudo da ação dos compostos fenólicos in vivo, pois em sua revisão não foram encontrados dados a respeito da absorção, biodisponibilidade em condições fisiológicas, e concentração plasmática ideal para a atividade de proteção dos fenóis contra os radicais livres e doenças associadas.

Conclusão

As análises realizadas neste trabalho revelaram a presença de flavonoides e elevado teor de compostos fenólicos nas folhas do Baru. Uma correlação positiva entre teor de fenóis totais e atividade antioxidante foram observadas, comparando-se os resultados da polpa e da folha. Destaca-se dessa forma, o grande potencial antioxidante evidenciado no extrato da folha. Como apontamentos de direções futuras recomenda-se estudos in vivo dos compostos fenólicos e o isolamento dos compostos responsáveis pela atividade antioxidante nas folhas do Baru.

Fontes de Financiamento

Instituto Federal do Norte de Minas (IFNMG) através do Cartão pesquisador e, também, foi apoiada pelo Programa Institucional de Bolsa de Iniciação Científica – PIBIC – IFNMG/FAPEMIG com bolsa para N. A. R.

Conflito de Interesses

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Agradecimentos

Ao Instituto Federal do Norte de Minas, pela disponibilização de recursos para a execução do projeto e concessão de bolsa de pesquisa.

Colaboradores

Concepção do estudo: CGR.
Curadoria dos dados: NAR; CGR.
Coleta de dados: NAR.
Análise dos dados: NAR; CGR; FVBN; PFS.
Redação do manuscrito original: NAR; CGR; FVBN; PFS.
Redação da revisão e edição: NAR, CGR.

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