Potenciais antibacteriano e antioxidante de chás das folhas de Casearia sylvestris var. lingua (Cambess.) Eichler (Salicaceae)

Resumo

As folhas da Casearia sylvestris Sw. (Salicaceae) são usadas em preparos aquosos para fins medicinais. A Casearia sylvestris var. lingua (Cambess.) Eichler (Salicaceae) é comum no cerrado e possui alto teor de compostos fenólicos. Os compostos fenólicos são compostos bioativos relacionados as atividades antimicrobiana e antioxidante. Neste contexto, foram preparados chás das folhas (infusão e decocção) de C. sylvestris var. lingua e avaliou-se os teores de compostos fenólicos, flavonoides e potenciais antioxidante e antibacteriano. Uma análise exploratória por espectroscopia nas regiões do ultravioleta-visível e infravermelho indicaram a presença de compostos fenólicos com perfis semelhantes nos dois extratos. A infusão e a decocção apresentaram teores de compostos fenólicos significativamente diferentes, porém, os teores de flavonoides e potencial antioxidante não apresentaram diferenças significativas. Em relação ao potencial antibacteriano, a infusão e a decocção apresentaram os mesmos valores, tendo a menor concentração inibitória mínima de 250 µg mL^-1 para Burkholderia cepacia, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus e Staphylococcus saprophyticus. A infusão e a decocção apresentam propriedades semelhantes com potencial antioxidante e antibacteriano, reforçando a indicação para uso externo como antisséptico.

Palavras-chave:

Antioxidante.

Compostos fenólicos.

Cafezeiro.

Guaçatonga.

Abstract

The leaves of Casearia sylvestris Sw. (Salicaceae) are used in aqueous preparations for medicinal purposes. C. sylvestris var. lingua (Cambess.) Eichler (Salicaceae) is common in the Cerrado and has a high content of phenolic compounds. Phenolic compounds are bioactive compounds related to antimicrobial and antioxidant activities. In this context, teas (infusion and decoction) were prepared from the leaves of C. sylvestris var. lingua and the contents of phenolic compounds, flavonoids and antioxidant and antibacterial potentials were evaluated. An exploratory spectroscopy analysis in the Ultraviolet-Visible and infrared regions indicated the presence of phenolic compounds with similar profiles in two extracts. The infusion and decoction showed significantly different levels of phenolic compounds, however, the levels of flavonoids and antioxidant potential did not show significant differences. Regarding antibacterial potential, infusion and decoction showed the same values, with the lowest inhibitory concentration of 250 µg mL^-1 for Burkholderia cepacia, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus and Staphylococcus saprophyticus. The infusion and decoction have similar properties with antioxidant and antibacterial potentials, reinforcing the indication for external use as an antiseptic.

Keywords:

Antioxidants.

Phenolic compounds.

Cafezeiro.

Guaçatonga.

Introdução

A Casearia sylvestris Sw. (Salicaceae) está presente principalmente na Mata Atlântica, Amazônica e no Cerrado. No bioma cerrado, a variedade mais comum é a Casearia sylvestris var. lingua (Salicaceae), um arbusto^[1] com folhas glabares, glandular-serrulada a serrada (FIGURA 1), apresentando grande variação morfológica das folhas^[2]. A C. sylvestris é tradicionalmente conhecida como cafezeiro^[3], folha de carne^[4], gançalinho^[5] e guaçatonga^[6].

Bortolotto et al.^[7] descreveu C. sylvestris na lista de plantas alimentícias de Mato Grosso do Sul. A infusão das folhas de C. sylvestris é muito utilizada na medicina popular, no tratamento de inflamações e úlceras gástricas^[1]. O Conselho Regional de Farmácia do Estado de São Paulo indica a infusão das folhas para tratamentos internos de dispepsia, gastrite e halitose; para tratamentos externos de dor, lesão, herpes labial, cicatrizante tópico e antisséptico^[8]. Os extratos aquosos das folhas da C. sylvestris possuem várias aplicações tradicionais, porém poucos estudos científicos, conforme revisão de Castro et al.^[9].

Os chás em geral são preparados por infusão e decocção. Na infusão, as folhas da planta medicinal são submersas em água fervente para que os princípios ativos sejam extraídos, enquanto que a extração por decocção ocorre quando a folha é cozida na água em ebulição^[10]. Uma das classes passíveis dessa extração são os compostos fenólicos^[11], essa classe de compostos possui atividade anti-inflamatória, antimicrobiana, anticarciogênica, fotoprotetora e antioxidante^[12,13].

Os compostos fenólicos apresentam atividade antioxidante devido a sua capacidade de neutralizar ou sequestrar os radiais livres e complexar com os metais oxidantes, sem perder a estabilidade por causa da sua capacidade de realizar ressonância no anel aromático^[14].

Há relatos de atividade antimicrobiana atribuídas aos compostos fenólicos^[15].  Silva et al.^[16] testou atividade antimicrobiana de compostos isolados do extrato etanólico da C. sylvestris. Já Espinosa et al.^[17]  realizou um estudo do efeito antimicrobiano nos extratos etanólicos da C. sylvestris, obtendo uma concentração inibitória mínima (CIM) de 1,25 mg mL^-1 para Staphylococcus aureus , Escherichia coli, 2,50 mg mL^-1 para Staphylococcus epidermidis e 5,00 mg mL^-1 para Pseudonomas aeruginosa. O estudo de Cavalheiro et al.^[18] abordou atividade antimicrobiana em extratos com diferentes solventes (água, etanol e metanol) das folhas de C. sylvestris frente a bactérias bucais, Staphylococcus mutans com CIM de 25 µg mL^-1, Staphylococcus mitis de 100 µg mL^-1, Staphylococcus salivarius 100 µg mL^-1, Lactobacillus casei 0,02 µg mL^-1 e Staphylococcus sanguinis de 100 µg mL^-1.

Bueno et al.^[1] demonstrou que a C. sylvestris var. lingua (Cambess.) Eichler apresenta teores superiores de compostos fenólicos em relação a C. sylvestris var. sylvestris (Salicaceae). Nesse sentido, é relevante realizar estudos dos potenciais de C. sylvestris var. lingua, tendo em vista a diferença nos teores de compostos fenólicos.

Com base nisto, este estudo avaliou os potenciais antibacteriano e antioxidante e os teores de metabólitos da infusão e decocção das folhas de C. sylvestris var. lingua.

Materiais e Métodos

Coleta e preparo do material

As folhas de C. sylvestris var. lingua foram coletadas em julho de 2021, na UFGD (Universidade Federal da Grande Dourados), em Dourados-MS, Brasil. A exsicata foi depositada no herbário de plantas medicinais da UFGD, sob código DDMS 6409 e foi realizado registro no SISGen sob código A72622B.

As folhas recém coletadas foram secas em estufa de ar circulante a 37 ± 2°C e triturada em moinho tipo Willey (Marconi) em peneira de 10 mesh. Após o peneiramento, as amostras foram acondicionadas em freezer a -20°C.

Extração

A extração foi realizada em julho de 2021. A decocção foi obtida fervendo folhas de C. sylvestris var. lingua na concentração de 20 g L^-1 por 10 minutos^[19]. Para o preparo da infusão, as folhas, na concentração de 20 g L^-1, foram maceradas em água na temperatura inicial de 95 oC em recipiente fechado, o qual permaneceu por 30 minutos tampado^[20]. Todos os extratos foram filtrados e liofilizados (Alpha 1-2LD Pluslyophilizer, Martin Christ). Os rendimentos obtidos da infusão foram de 17,2% e da decocção de 17,5%.

Varredura na região do Ultravioleta-Visível (UV-Vis)

Os extratos foram preparados na concentração de 0,2 mg mL^-1 em água destilada. Foram realizadas três varreduras em um espectrofotômetro UV/Vis (Global Trade Tecnology) para cada amostra entre os comprimentos de onda de 200 e 600 nm, com 1 nm de resolução utilizando uma cubeta de quartzo e realizando a média dos espectros.

Teor de compostos fenólicos pelo método de Folin-Ciocalteu

A amostra foi diluída na concentração de 1 mg mL^-1 em água destilada. Em frascos penicilina, foram adicionados 0,5 mL de reagente de Folin-Ciocalteu (1:10 v/v) e 1 mL de água destilada em 0,1 mL de amostra. Após 1 minuto, adicionou-se 1,5 mL de carbonato de sódio 20% (m/v) e esperou-se a reação por 2 horas, mantendo a amostra em local escuro. Por fim, a amostra foi lida em um espectrofotômetro UV/Vis no comprimento de onda de 760 nm empregando cubeta de vidro^[21].

A análise foi realizada com cinco réplicas. No preparado do branco foi substituída a amostra por água destilada e o restante do procedimento de preparo foi o mesmo descrito acima empregado para as amostras. Para quantificação, foi elaborada uma curva analítica com ácido gálico submetido ao mesmo método empregado nas amostras. Os resultados foram expressos em ácido gálico equivalente por grama de amostra liofilizada (mg AGE ^-1)

Teor de flavonoides pelo método do cloreto de alumínio

A amostra nesse teste foi preparada da mesma concentração que na análise de compostos fenólicos. Em frascos penicilina, foram adicionados 1 mL de cloreto de alumínio 2% (m/v) em metanol em 1 mL da amostra, aguardando a reação por 15 minutos e realizando a leitura em um espectrofotômetro UV/Vis no comprimento de onda de 430 nm empregando cubeta de vidro^[21].

No preparado do branco foi substituída a amostra por água destilada e o restante do procedimento de preparo foi o mesmo descrito acima empregado para as amostras.  As análises foram realizadas em quintuplicata. Uma curva analítica foi elaborada com rutina submetida ao mesmo método empregado nas amostras e os resultados foram expressos em rutina equivalente por grama de amostra liofilizada (mg RE g^-1).

Espectroscopia no infravermelho

A análise foi realizada diretamente nos extratos liofilizados. O equipamento empregado foi um espectrofotômetro (Thermo-Nicolet Nexus 670 spectrophotometer) com detector fotoacústico (MTEC-300). Foi empregado purga com ar seco no espectrofotômetro e entre as leituras com hélio na câmara fotoacústica. O background foi obtido com uma referência preta para calibração do equipamento. A leitura ocorreu entre 4000 cm^-1 e 400 cm^-1 com 128 scans, com resolução de 8 cm^-1.

Potencial antioxidante empregando o DPPH

As amostras foram preparadas em concentrações entre 1 e 5 mg mL^-1 em água destilada. A análise foi realizada em frascos penicilina empregando 0,1 mL das amostras e 2 mL do radical DPPH (2,2-difeniL^-1-picrilhidrazril) 0,004% em metanol^[22], resultando em diluições entre 47,62 e 238,10 µg mL^-1. As amostras foram incubadas por 30 minutos em local escuro, com posterior leitura em espectrofotômetro UV/Vis no comprimento de onda de 517 nm em cubeta de vidro^[22].

Foi calculado a porcentagem de inibição de cada réplica das diluições das amostras^[13]. Para determinação da concentração inibitória (CI50) média, foi utilizada regressão linear para estimar a concentração necessária para inibir 50% do radical DPPH ^[13,20], obtendo R² de 0,928 para a infusão e 0,959 para a decocção.

Concentração inibitória mínima frente às bactérias

A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi realizada em triplicata em concentrações do extrato entre 62,5 e 1000 µg mL^-1, da metodologia descrita por Bernardi et al.^[23]. Foram empregadas as cepas de bactérias: Burkholderia cepacia (NEWP 0059), Enterococcus faecalis (ATCC29212), Escherichia coli (ATCC 38731), Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853), Staphylococcus epidermidis (ATCC12228), Staphylococcus aureus (ATCC 25232) e Staphylococcus saprophyticus (ATCC15305). As cepas foram adquiridas da American Type Cultura Collection – ATCC, North East White Pride – NEWP.

Os microrganismos testados foram inoculados em caldo nutriente Brain Heart Infusion (BHI) e incubadas a 37°C por 24 horas para reativação das cepas. Os microrganismos foram semeados em placa contendo ágar Mueller Hinton e incubados novamente a 37°C por 24 horas em estufa bacteriológica. Após o crescimento, o inóculo microbiano foi padronizado em salina 0,9% em uma turvação equivalente ao tubo 0,5 da escala de MacFarland, equivalente a 1 x 108 UFC mL^-1 (UFC – Unidade Formadora de Colônias), diluídos 1:10, um padrão de turvação utilizado para determinar a intensidade da multiplicação em meios de cultivo líquidos.

A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi realizada utilizando microplacas de 96 poços (orifícios), devidamente esterilizadas. Aos poços foram adicionados volume padrão de 100 µL de caldo Mueller Hinton para bactéria e caldo Saboraud para fungo. Para cada microrganismo testado, 100 µL da peçonha foram adicionadas sob microdiluição seriada em caldo (1000; 500; 250; 125; 62,5 µg mL^-1).  Por fim, uma alíquota de 10 µL dos microrganismos padronizados em salina 0,9%, foi adicionado. O controle positivo utilizado foi tetraciclina na concentração de 50 µg mL^-1 e como controle negativo água ultrapura, usada na diluição inicial das amostras. Após a preparação e homogeneização dos poços, as microplacas foram incubadas por 24 horas a 35°C. A CIM foi determinada por meio de leitura em espectrofotômetro de microplacas (TP Reader NM, Thermo Plate) a 580 nm de absorbância.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada no software R. Foram analisadas a homogeneidade das variâncias das amostras e a normalidade dos dados pelo teste de Shapiro-Wilk. Posteriormente, foi realizado o teste t bilateral com nível de significância de 5%.

Resultados e Discussão

A varredura na região UV-Vis mostra que a absorção das amostras é concentrada na região do ultravioleta (FIGURA 2). Cardoso et al.^[20] obtiveram um perfil semelhante para a infusão das folhas de C. sylvestris var. lingua.

A decocção e a infusão apresentam espectros semelhantes, com picos em comprimentos de ondas próximos. A decocção apresenta maior absorbância em relação a infusão para as folhas de C. sylvestris var. lingua (FIGURA 2).

As frequências vibracionais do estiramento e dobramento das moléculas absorvem na região do infravermelho, possibilitando a identificação dos grupos funcionais^[24]. A infusão e decocção apresentaram picos em regiões semelhantes e com intensidades diferentes (FIGURA 3). Os resultados indicam que, possivelmente, os chás preparados por infusão ou decocção apresentam composição química semelhantes.

Os compostos fenólicos apresentam em sua estrutura anéis aromáticos com hidroxilas e podem estar ligados a açúcares^[25]. Existem deformações associadas a presença de compostos fenólicos na decocção e infusão das folhas de C. sylvestris var. lingua (TABELA 1).

Nos métodos de preparo por infusão e decocção, o teor de compostos fenólicos é significativamente diferente (p<0,05), enquanto os flavonoides e o potencial antioxidante não apresentam diferença significativa (p>0,05) (TABELA 2). A decocção apresenta maior teor de compostos fenólicos em relação a infusão.

Previamente, Espinosa et al.^[17] realizou testes fitoquímicos em extratos etanólicos das folhas de C. sylvestris que confirmaram a presença de compostos fenólicos e flavonoides. Bueno et al.^[30] e Carvalho et al.^[31] conseguiram identificar flavonoides na C. sylvestris var. lingua. De acordo com Bueno et al.^[1], a C. sylvestris var. lingua prevalece na área do cerrado, possuindo altos teores de flavonoides em sua composição.

Cardoso et al.^[20] estudaram a infusão das folhas da C. sylvestris var. lingua, identificando teores próximos aos obtidos neste estudo, com 101,57 mg GAE g^-1 de compostos fenólicos e 50,37 mg RE g^-1 de flavonoides.

Estudos tem demonstrado que os compostos fenólicos podem exibir atividades antioxidante e antimicrobiana^{[12-15,32,33]}. Geralmente, os compostos fenólicos possuem atividade antioxidante devido a sua capacidade de doar hidrogênio ou elétrons, aos seus radicais intermediários estáveis que impedem a oxidação, quebrando reações em cadeia^[4,32].

Mosaddik et al.^[34] mostraram que os extratos metanólicos de cinco espécies do gênero Casearia apresentaram potencial antioxidante com uma variação de CI50 entre 2,9 a 55,7 μg mL^-1. Cardoso et al.^[20] mostraram que na infusão a C. sylvestris var. lingua apresentou um potencial antioxidante de 161,29 ± 0,93 µg mL^-1. A diferença entre os potenciais antioxidantes do presente estudo (TABELA 2) e do estudo de Cardoso et al.^[20] pode estar associado a variação de data de coleta, assim impactando nos teores de compostos fenólicos e flavonoides.

Os extratos aquosos obtidos por infusão e decocção apresentaram ação frente as bactérias (TABELA 3). Os compostos fenólicos podem ser responsáveis pela atividade antimicrobiana de extratos vegetais^[35]. É possível que a atividade antimicrobiana observada esteja associada com os teores de flavonoides, já que estes metabólitos não foram significativamente diferentes nas duas formas de preparo.

No estudo de Silva et al.^[16], foi isolado o composto éter isobutil galato-3,5-dimetílico do extrato etanólico das folhas de C. sylvestris que obteve atividade antimicrobiana para as bactérias E. coli de 156,0 µg mL^-1; P. aeruginosa de 312,0 µg mL^-1; E. faecalis de 9,8 µg mL^-1 e S. aureus de 9,8 µg mL^-1 e também  isolaram o composto éter metil galato-3,5-dimetil com atividade inibitória mínima frente as bactérias E. coli na concentração de 312,0 µg mL^-1, 624,0 µg mL^-1 para P. aeruginosa, 39,0 µg mL^-1  para E. faecalis e 39,0 µg mL^-1 para S. aureus.

Espinosa et al.^[17], realizaram um estudo sobre os extratos etanólicos de C. sylvestris e obteve uma CIM para as seguintes bactérias:  E. coli (1,25 µg mL^-1), P. aeruginosa (5,00 µg mL^-1), S. aureus (1,25 µg mL^-1) e S. epidermidis (2,50 µg mL^-1).  Cavalheiro et al.^[18] realizaram um estudo sobre o potencial antimicrobiano contra as bactérias bucais e os extratos aquosos não mostraram atividade frente a estas bactérias.

Conclusão

A decocção das folhas da C. sylvestris var. lingua apresenta teor significativamente superior de compostos fenólicos em relação a infusão. Entretanto, nos chás não há diferença significativa nos teores de flavonoides e potencial antioxidante.  A infusão e a decocção da espécie apresentaram potencial antibacteriano, reforçando a indicação para uso externo como antisséptico, além de não haver diferença nesta propriedade em relação ao tipo de preparo.

Fontes de Financiamento

FUNDECT (número de concessão 71/700.139/2018; 036/2018 e SIAFEM 028991).

Conflito de Interesses

Não há conflito de interesses.

Agradecimentos

Ao Grupo de Espectroscopia Óptica e Fototérmica (GEOF) da UEMS pelo empréstimo do equipamento de infravermelho. CNPq para CALC (número de concessão 312671/2021-0) e pela bolsa de iniciação científica (CNPq-UEMS-PIBIC) para LPS e a CAPES pela bolsa concedida ao TLAC (Código 001).

Colaboradores

Concepção do estudo: LPS, TLAC; CALC
Curadoria dos dados: TLAC; CALC
Coleta de dados: LPS; TLAC
Análise dos dados: LPS; TLAC
Redação do manuscrito original: LPS; TLAC
Redação da revisão e edição: CALC

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